黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案

1、黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案一、黄曲霉毒素介绍黄曲霉毒素 (aflatoxin, 简称为 AF 是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。 它可通过多种途径污染食品和饲料, 直接或间接进入人类食物链, 威胁人类健康 和生命安全, 对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重, 该毒素是黄曲霉和寄 生曲霉中产毒菌株的代谢产物, 普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。 黄曲霉毒 素比较耐热,加热至 230 才能被完全破坏,因此一般烹饪加工也不易消除。 二、黄曲霉毒素对人体的危害1、 引起急、慢性中毒:黄曲霉毒素是剧毒物质, 其毒性相当于氰化钾的 10倍, 砒霜的 68倍。 黄曲霉毒 素属肝脏毒,除抑制

2、DNA 、 RNA 的合成外,也抑制肝脏蛋白质的合成,黄曲霉 毒索引起人类的急性中毒事件, 国内外均有许多报导, 最典型的是印度的霉变玉 米事件,该事件直接导致了数十人丧生,数百人患上不同类型的肝脏疾病。 2、 致癌性:黄曲霉毒素有极强的致癌性, 长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。 它诱发肝癌的 能力比二甲基亚硝胺大 75倍, 是目前公认的致癌性最强的物质之一。 另据世界卫 生组织报导,黄曲霉毒素含量在 3050ug/kg时为低毒, 50100ug/kg时为中毒, 1001000ug/kg时为高毒, 1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大 危害性, 我国对其在食品中的含量作了严格

3、规定, 其中, 乳制品中黄曲霉毒素最 高允许量为 5ug/kg(即 5ppb 。三、黄曲霉毒素的种类黄曲霉毒素主要有 4种:即 B 1、 B 2、 G 1、 G 2,其中 B 1被认为是主要的有毒物质, 有 2种这些毒素的代谢产物 M 1和 M 2。 其中黄曲霉毒素 B 1主要存在于农产品, 动物饲料,中药等产品中;黄曲霉毒素 M 1 是动物摄入黄曲霉毒素 B1后在体内经羟基化代谢的产物,一部分从尿和乳汁排出,一部分存在于动物的可食部分,如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中,其中以乳最为常见。黄曲霉毒素 M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素 B1的基本相似。 由于牛乳及其制品是人类、 特别是婴儿的主要食品

4、,所以其危害性更大。四、最新政策及国标(含国外一些政策1、 自 2003年 8月 1日起,凡在我国境内从事米、面、油、酱油、醋生产加工的企 业,其产品须经检验合格后方可上市。国家质检总局发布的关于印发小麦 粉等 5类食品生产许可证实施细则的通知 中明确规定, 黄曲霉毒素 B 1必须检 测。2、 在第八期 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报 中发布关于黄 曲霉毒素检测方法的最新国标:(1、 GB/T 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层净化高效 液相色谱法和荧光光度法(2、 GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素 M1的测定 免疫亲和层净 化高效液相色谱

5、法和荧光光度法以上两项国标均在 2003年 8月 1日开始实施3、 2002年 2月 4日欧盟决议对从中国进口或委托从中国进口的花生和花生制品实 施黄曲霉毒素强制性检测的特殊条件五、中国及国际上对黄曲霉毒素的检测标准1、主要国家: 2、其他(1、 WHO/FAO标准。国际卫生组织 (WHO/世界粮农组织所属的食品法典委 员会 (CAC推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量 (B1+B2+G1+G2 小于 15g/kg;牛奶中 M 1的最大允许量为 0. 5g/kg(2、南非标准。 1990颁布了黄曲霉毒素的最大允许标准:食品中黄曲霉毒素 总量小于 10g/kg,其中黄曲霉毒素 B 1小

6、于 5g/kg。(3、其他标准。印度标准是花生中黄曲霉毒素 B 1小于 30g/kg;越南和阿根廷 的标准为黄曲霉毒素 B 1小于 20g/kg。六、黄曲霉毒素检测方法测定黄曲霉毒素测定的方法有薄层色谱法、 高效液相色谱法、 酶联免疫吸附测 定法、质谱法、放射免疫测定法。这些方法中,国标方法 “ 免疫亲和柱法 ” 是现在 国际公认的比较经济有效的分析方法。 有着较好的权威性和通用性, 且为国外多 个组织认可,被列为标准方法,如:美国公职分析化学家协会(AOAC 美国农业部联邦谷物检测中心(FGIS 国际纯粹与应用化学协会(IUPAC 美国食品药品行政署(US-FDA 美国农业部(USDA 同时

7、在国内被认证的机构:中国出入境检验检疫局(CIQ 七、黄曲霉毒素检测 “免疫亲和柱法”方法有以下特点:1、 认证机构广泛,通用性强2、 分析速度快,一个样品只需 10-15分钟,其他传统的方法要做到定量分 析需要几小时至几天的时间。3、 灵敏度高,测定范围广泛(0-300ppb , 用荧光计可以测定 0.1ppb 的黄 曲霉毒素四种异构体,用 HPLC 可以检测出 10ppt 的黄曲霉毒素 B1。4、 采用单克隆免疫技术,可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分离 出来,分离效率和回收率高,正确性和可靠性强。八、黄曲霉毒素检测 “免疫亲和柱法”方法具体步骤如下:1、试剂配制(1样品提取溶剂:甲

8、醇 /水(4/1, v/v(2 5mmol 磷酸盐缓冲溶液(PBS (pH7.2母液配制:1称取 50.14gNa 2HPO 4.12H 2O 溶解于 700ml 水中。2称取 9.66gNaH 2PO 4.H 2O 溶解于 350ml 水中。3 将上述两种溶液进行混合并加入 42.5gNaCl , 配制成 pH7.2 5mmol磷酸盐缓冲溶液(3 1mmol 磷酸盐缓冲溶液 (PBS(pH7.2工作液配制:取 200ml 的 5mmol 磷酸盐缓冲溶液(pH7.2稀释于 800ml 水中。 (4磷酸盐缓冲溶液(PBS /吐温 (Tween配制:取 8ml 吐温 -20稀释于 92mlpH7.

9、2磷酸盐缓冲溶液中(5 HPLC 流动相配制:水 /甲醇 /乙腈(60/30/15,v/v2、样品处理方法:方法一:标准方法该处理程序适用于样品基质中没有干扰,主要适用于大多数谷类样品的处理。 1、取 20g 样品加入 100ml 提取液(甲醇 /水, 4/1, v/v放入匀浆机中,并高速 搅拌 5分钟。2、用滤纸过滤上述提取液3、取 14ml 过滤后的提取液加入 86ml 的 1mmolPBS 缓冲溶液(pH 7.2 。如果样 品量比较少,取样品体积可以适当减少(如 1.4ml+8.6ml缓冲溶液 。如混合过 程中有沉淀产生,样品需要用注射过滤器进行过滤或进行离心。4、打开净化柱上密封盖和下

10、面堵头后,柱中的缓冲溶液会排出,直到缓冲溶液 液面达到柱中填料上层处。5、取 5-50ml 稀释后的提取液(取样体积根据分析方法的灵敏度来确定上 AflaCLEAN TM 柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压;但必须保证过柱 流速不大于 1-2滴 /秒。尽量让所有上样样品都通过柱子流出来,即使柱中溶剂 流干了也没有太大问题,但是要避免柱子溶剂完全流干。6、用 10ml 蒸馏水或纯化水清洗柱子7、用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水8、每次用 1ml 甲醇洗脱柱子,可洗 2次。第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子 下端,使甲醇在净化柱中保持 5min 后,再放出收集。9、根据分析的需要对洗脱液进

11、行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析。方法二:标准方法加正己烷分层该样品处理方法针对样品中含有油脂比较多, 如坚果类, 一些香料或无花果酱, 脂肪和样品中含有一些需要用正己烷去除的杂质。1、称取 20g 样品并加入 2g 的氯化钠2、加入 100ml 提取溶剂(甲醇 /水, 4/1, v/v和 50ml 正己烷于匀浆机中高速搅 拌 5min 。3、静止分层,取下层液进行下一步处理4、取下层液用滤纸过滤5、取 14ml 过滤后的提取液加入 86ml 的 1mmolPBS 缓冲溶液(pH 7.2 。如果 样品量比较少,取样品体积可以适当减少(如 1.4ml+8.6ml缓冲溶液 。如混 合过程中有

12、沉淀产生,上柱液需要用注射过滤器进行过滤或进行离心。6、打开净化柱上端密封盖和下端堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶 液液面达到柱中填料上层处。 7、取 5-50ml 稀释后的提取液（取样体积根据分析方法的灵敏度来确定）上 AflaCLEANTM 柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压；但必须保证过 柱流速不大于 1-2 滴/秒。尽量让所有上样样品都通过柱子流出来，即使柱中 溶剂流干了也没有太大问题，但是要避免柱子完全溶剂流干。 8、用 10ml 蒸馏水或纯化水清洗柱子 9、用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水 10、 每次用 1ml 甲醇洗脱柱子，可洗 2 次。第一次加入的甲醇需用堵

13、头堵住 柱子下端，使甲醇在净化柱中保持 5min 后，再放出收集。 11、 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析。 方法三： 方法三：标准方法加正己烷分层和 PBS/Tween 稀释 该处理过程用于样品含有干扰杂质，主要是大部分的香料和中草药。 1、此处理过程样品最大取样量为 20g（一些样品需要减少取样量可以达到比较 好的提取效果） 。 2、称取 20g 样品并加入 2g 氯化钠 3、样品先进行均质化处理，向处理好的样品中加入 100ml 提取溶剂（甲醇/水， 4/1，v/v）和 50ml 正己烷于匀浆机中并高速搅拌 5min。 4、提取液静止分层，取下层溶液进行下

14、一步处理 5、取下层溶液用滤纸过滤 6、取 5ml 滤液加入 35mlPBS/Tween 溶液稀释。如稀释混匀中出现沉淀，需用注 射过滤器进行过滤或离心。 7、打开净化柱上端密封盖和下端堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶 液液面达到柱中填料上层处。 8、取 14ml 稀释后的提取液（取样体积根据分析方法的灵敏度来确定）上 AflaCLEANTM 柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压；但必须保证过 柱流速不大于 2ml/min。尽量让所有上样样品都通过柱子流出来，即使柱中 溶剂流干了也没有太大问题，但是要避免柱子完全溶剂流干 9、用 10ml 蒸馏水或纯化水清洗柱子 10、 11、 用

15、气体吹扫或抽真空除去柱子中的残余的水 每次用 1ml 甲醇洗脱柱子，可洗 2 次。第一次加入的甲醇需用堵头堵住 柱子下端，使甲醇在净化柱中保持 5min 后，再放出收集。 12、 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析 3、HPLC 分析方法： 黄曲霉毒素检测需要一台配有荧光检测器的 HPLC 系统。 黄曲霉毒素 HPLC 分析检测条件可参照以下设定： 流动相：水/甲醇/乙腈 60/30/15 (v/v； 流速：1.2ml/min 进样量：10-100µL；柱温：36 HPLC 黄曲霉毒素专用分析柱：150×4.6mm；RP C18（货号：10522

16、） 荧光检测器设置：EX.:365nm;Em.:460nm (使用柱后衍生系统， 详见柱后衍生技术 或 Em.:430nm 用于黄曲霉毒素 B 类的检测和 455nm 用于黄 曲霉毒素 G 类的检测 4、柱后衍生技术 在 HPLC 分析中，为提高一些检测痕量目标物的灵敏度（如黄曲霉毒素 B1 和 G1） ，需要对检测的目标物进行衍生化，目前在 HPLC 中，以柱前衍生法和柱后 衍生法居多，但柱前衍生法由于操作过程较繁琐，容易影响定量的准确性，不适 合用于对大量样品做常规检测，而柱后衍生法操作简单，可连续反应以实现自动 化分析，适用于大量样品的连续的自动化操作。LCTech 公司现有 UVETM

17、 光化学 柱后衍生设备 LCTech 的 UVETM 柱后衍生设备（如图 1，P/N 10519）是最简单，最便捷和性 价比高的柱后衍生设备。 只要将该设备连接到 HPLC 柱出口和荧光检测器的进口 之间可以使用。 该设备不需要任何试剂， HPLC 流动相的水就可以作为反应试剂。 当分析时不需要使用该设备， 只要将设备电源关闭就可以了， 不需要额外的操作。 图 1 LCTech 公司的 UVETM 系统 图 2 Aflatoxin B1 光化学衍生到 AflatoxinB2a 的过程 虽然黄曲霉毒素 B2 和 G2 在荧光检测器上有很好的响应值，但是黄曲霉毒素 B1 和 G1 需要进行衍生才可

18、以在荧光检测器上有好的响应值。这个过程可以通 过 UVETM 在 254nm 紫外光照射下进行光化学反应完成。 通过黄曲霉毒素 B1 和 G1 进行羟基化（在双键结构上加一分子水，如图 2） ， 并产生稳定可测的荧光。这个光化学反应过程不影响其他黄曲霉毒素 B2 和 G2 化学和检测性质。 一般来说，检测方法的检出限与样品前处理过程和荧光检测器的性能有关。如 果仪器灵敏度足够好，黄曲霉毒素经 AflaCLEANTM 柱净化后直接检测，其检测 限可达到 ppt 级。 图 3 使用 UVETM 柱后衍生化处理黄曲霉毒素 HPLC 检测的色谱图比较 6a 图是 UVETM 打开的结果，6b 是 UVETM 关闭的结果 5、黄曲霉毒素分析实验室配置 1、仪器 货号 10514：AflaCLEANTM 黄曲霉毒素免疫亲和柱 货号 10081：三指型烧杯夹，用于固定 120ml 免疫亲和柱上样瓶； 货号 10896：120ml 免疫亲和柱上样瓶，DURAN 玻璃，包含盖和密封垫 货号 10519：UVETM 黄曲霉毒素紫外柱后衍生仪，CE 认证 货号 10522：黄曲霉毒素专用 HPLC 分析柱， 货号 10523：预柱（3 个/包） ； 货号 10750：预柱套； 货号 10837：黄曲霉