植物响应寒冷胁迫的CBF基因表达调控

1、植物响应寒冷胁迫的CBF®因表达调控寒冷胁迫是农林业生产中一种严重的自然灾害，世界每年因此造成的损失十分巨大。自然环境下温度是决定植物地域分布的主要限制因子，在栽培条件下更影响着农作物及园艺植物等的产量和品质，低温对植物的影响尤为突出。低温胁迫常使某些起源于热带、亚热带地区的植物因冷敏感性而无法在温带以北地区露地安全越冬，这就给引种带来不利，因此，探明植物抗寒性形成的生理机制和遗传因素，不仅在理论上具有重要的科学意义，在解决生产实际问题上也具有厂泛的应用价值。经过研究，至今人们己在植物抗寒的形态学、生理生化、生物物理、生态及细胞遗传学方面取得广泛进展，随着生物技术的发展，有关植物抗寒

2、的分子生物学研究成为近十年的研究热点之一，导入外源基因提高植物的抗寒性已成为现代植物育种的主要手段，并开始逐步探索利用基因工程手段进行植物抗寒育种及有关生理研究。1 CBF家族拟南芥CBF/DREB僖因家族是一个包括CBF1CBF2CBF3CBF4CBF5CBF6的小基因家族。虽然CBF4与其他CBF具有相同保守的AP2区域，但CBF4不受低温诱导，而是受干旱诱导，是一个抗旱转录因子。过量表达的CBF4转基因拟南芥植株，其抗旱性和抗寒性均明显提高。CBF么CBF2和CBF3基因在拟南芥中属于一个编码同蛋白的基因小家族，具有快速冷诱导表达特性。这3个基因连锁于拟南芥4号染色体的短臂上，与分子标记

3、m60QpG11紧密连锁。CBF4定位于5号染色体上1。CBF1/2/3蛋白结构中有pkkpagrkkfretRhifadsawR特异氨基酸识别蛋白，还发现具有与蛋白激酶C和酪蛋白激酶n结合的位点2oCBFs与它们靶细胞的启动子中CRT/DRT（C-重复元件/干旱响应元件）元件结合并且诱导这些基因的转录以响应低温。CBF碓寒冷驯化过程中是重要的组件；三个低温诱导CBFs的过表达植株导致了在温暖条件下CBF靶基因的诱导，并且不需要经过寒冷驯化就可具有耐寒性的能力3。2 CBF转录因子基因的调控网络2.1 CBF/DREB1春化途径春化发育特性是植物的重要性状，由春化相关基因调控，低温是春化发育中

4、关键因素。许多植物在遭受严寒前,若经过一个缓慢的降温过程,抗寒性会逐渐提高,这一过程称为低温驯化。CBF基因在耐寒方面的作用对拟南芥进行了详细的研究，低温驯化期间拟南芥大约20%勺基因表达都直接或间接受CBFW录因子的调控4。拟南芥中CBFs直接靶基因包括CORE因强烈的诱导表达5。谷物中类似的CBF靶基因，其上游调控区域也含有CRT/DRE%件6。图1Stockinger等7大麦5号染色体长臂在FR-H2基因位点上CBF基因和VRN-H1/Fr-H1基因的示意图.CB崔因不仅受寒冷诱导，而且也受VRN-H1负调控影响。冬季型大麦表达VRN-H1蛋白的vrn-H1基因需要经过越冬才表达，因为V

5、rn-H1是不表达的。不同因素会影响Vrn-H1的表达。VRN-H1的活性可能直接抑制CBF表达，或者可能导致中间物质激活来抑制CBF表达，或者两者同时在转录前或转录后水平上起作用。如图1所示，冬麦基因型已经分离出两个主要基因座，Fr-1和Fr-28。Fr-1和Fr-2位于部分同源群5号染色体上，之间距离20-50cm取决于群体定位不同9。大麦中Fr-1基因表示为Fr-H1（H表示大麦）。VRN1编码蛋白为MAD嬖转录因其受低温诱导促进开花，是植物由营养生长向生殖生长转变的关键因子10 。VRN-1共同隔离的Fr-19,两个关键位点之一均可调节小麦的春花需求。对于Fr-2上CBF同源基因表达的

6、调控可能是复杂的，这种复杂性取决于内源性和外源性的相互作用。VRN-1/Fr-1是一个部分负调控在Fr-2的某些CBF基因。VRN-H1通过一个连锁基因在VRN-H1/Fr-H1发挥多效性作用对CBF表达产生负影响。因为VRN-1是一个MADSDN结合蛋白，它可能直接结合到CBF基因组区域，或者可能间接影响其他调控因子来控制CBF表达。冬季中携带vrn-1等位基因的基因型的CB崔因表达比春季生长中携带vrn-1等位基因的基因型的CB法达水平更高7。除此之外，一旦冬季携带等位基因vrn-1的基因型受到春化作用，其CBFW录水平抑制到与非春化植物相同的水平7o这表明，VRN-1会抑制在FR-2位置

7、的CBFs的表达，从而降低抗冻性。群体分离的VRN-H1携带隐性vrn-H1等位基因的植株比携带显性vrn-H1等位基因的植株具有更高的CBF和COFg因的转录水平7。此外，当植物受到冷胁迫后，短日照下植株（减少VRN-H1水平）的CBF和COR专录水平明显高于长日照处理的植物。植物体内多种CBF基因以及下游COR®基因转录水平的降低伴随着VRN-1转录水平增加可以为植物进入生殖生长阶段后对寒冷耐受性降低提供合理的解释。拟南芥成花激活MAD流式基因SOC随过直接抑制CBFg因作为冷响应途径的负调控子11o拟南芥哥伦比亚野生型株系，SOC休E叶片中表达最强烈，在根尖花序和茎段中也可检测

8、到其表达。socl突变型和SOCti表达株系中三个CBF基因表达水平增加了，而CBF的调控基因ICE1,HOS1和ZAT12的转录水平均未受到影响。染色质免疫沉淀实验证明相比socl突变型，SOC他表达植株体内CBF启动子中富集了CArG盒式区域，这说明SOC1®过直接抑制CBF基因转录来负调控寒冷响应11。有趣的是，小麦中与拟南芥SOC1WSOC的同源基因表达不受春化作用和光周期的影响，这表明不同物种同种基因不同功能10。虽然拟南芥SOC休口谷物VRN-1似乎与叶片中CBF和CORE因下调控制相关，拟南芥中VRN-1对CBF基因的影响似乎不同于SOC1MCBF基因的直接影响。拟南芥

9、soc1突变型表现为CBF基因对寒冷响应增强以及提高的抗冻性，这说明秋季SOCM氐水平转录有利于植物适应寒冷环境11oSOC转录水平伴随着拟南芥开花初始时间强烈增加，这表明SOC扃转录水平将会对CBF基因和他们的下游CO砌基因进行下调控制。2.2 响应低温的CBFs调控表达当植物暴露于4环境后，15min内低温响应转录因子CBF1,2和3的积累会快速表达12o还冷中植物CBF转录因子在2左右出现高峰，然后会下降到一定程度略高于温暖环境下它们的表达。一旦将植物移入温暖环境，CBFW录因子便快速降解12。ICE1,一个类似MYCbHLH!以结合到MYCH别位点的蛋白，研究表明它参与CBFs的诱导1

10、3o这个bHLH转录因子的一个点突变会造成低温响应CBF3表达剧烈减少。ICE1是HOS值素化目标蛋白，HOS傀一个E3连接酶也是寒冷驯化的负调控子14。SIZ1,一个SUMO-E31接酶，可以阻止ICE1的泛素化，导致低温响应的CBFs表达量增加15o虽然CBF1和CBF2的启动子中具有MYCH别序列，ice1突变体中CBF1和CBF2的表达水平受到影响，说明低温响应的三个CBF转录因子的调控表达可能是想法独立的。对比ice1突变体，这个基因完全敲除后CBF1/2/3的表达水平并没有显著影响，说明除了ICE1之外还可能有别的因子调控CBFs的表达。过表达ICE1植株内增加了低温响应转录因子C

11、BF2和CBF3mRNA勺积累。然而，温暖条件下ICE1过表达植株内并没有诱导出三个CBFs，说明ICE1单独表达不足以诱导CBFs。植物体内可能具有ICE1无法克服的抑制因子，ICE1修饰或者仅在低温环境时另一些调节子会发挥作用或者CBFmRN照定性的改变。环己酰亚胺处理也会诱导CBFmRNA）积累，这种结果的一个解释是一个潜在负调控元件对于CBFs的温暖抑制重要性12oMYB1导口ZAT12作为CBFs的负调控子。MYB1序口ZAT12的过表达均会减少CBFs低温诱导的积累16oMYB1驮失植株会增加某些低温响应的潜在因子的积累16。然而，MYB1喊ZAT12基因敲除后CBFs的影响不受影

12、响，可能由于在拟南芥内大型MYB和锌指结构家族具有冗余基因或者由于在CBF调控中某些潜在负调控元件的功能所致。2.3 寒冷驯化的非依赖CBF途径有趣的是，许多寒冷敏感植物，例如番茄包含低温诱导的功能性CBF蛋白。番茄中CBF1是受寒冷诱导的，并且与拟南芥的功能相同，当CBF1过表达导致拟南芥获得连续耐寒性17。然而，即使拥有这个寒冷诱导的功能性CBF蛋白，番茄依然不具有耐寒性。这说明番茄中CBF下游所需的组件可能丢失或者拟南芥中存在另外的可以提高耐寒所需组件的途径而番茄中没有这些途径。突变体实验证明影响耐寒性的机制与CBF途径相互独立。esk1突变体连续性耐寒，然而植株并没有表现出CBFs或一

13、些CBF靶基因水平显著增加18。esk1突变体内积累了高水平脯氨酸（冷冻保护剂），暗示了一个解释耐寒性增强的可能机制。然而，ESK1编码一个含有未知功能区域的新蛋白，所以脯氨酸水平增加以及耐寒性增加的机制仍然未知。MYB专录因子内一个突变,hos10,会影响ABA生物合成基因NCED3勺调控，最终导致耐寒性降低而CBF调节子基因COR15aRD292ADHff口KIN1的表达增加19o耐寒性诱导中存在一个功能性CBF途径意味着单独CBF途径可能不足以完全提供给野生型耐寒性。3应答其他环境因子的CBFs调控表达植物对不同环境信号的重叠响应表达时，研究了响应多种环境因素的CBFs复杂表达调控。昼夜

14、规律对CBF诱导也有影响。由于昼夜规律温暖条件下CBF3mRN冰平在早晨达到高峰。重要的是，生物钟对CBF低温诱导具有影响，钟门控制着诱导。当植物移入凌晨低温环境下，这与CBF渥夜表达的高峰时间相抵触，寒冷中CBFs的诱导水平高于处于CBF表达低谷移入寒冷环境的植株20o这说明氧化钟与冷信号共同作用确保CBFs的诱导以及在合适时间作出寒冷的响应。用相同的方式，证明光量子对寒冷诱导的CBFs以及它们靶基因转录也有影响。一个与GUSa合并含有四个拷贝CRT勺报告基因发现需要光照才能进行低温诱导。一个10min的红光脉冲足以完成这个低温响应；然而，当红光脉冲后紧跟着远红光脉冲的话这种低温响应就会被消

15、除21。这个实验说明光敏色素可以调控低温响应。Kim等证明了这是一个依赖光敏色素B的响应。这个光量子参与调解CRT元件的实验说明CBFs本身响应光照后进行积累调控或者光照信号处于介于CBFmRNAR累和CBF基因调控之间的下游监测点发挥作用。光量子信号已证明在16调节CB腺录因子的诱导。红光与远红光低的比率就能导致16c时CBF诱导量增加。此外，这种低比率红光/远红光的光照实验可以在16提高种子的耐寒性，而22下则不能22。因此光信号的参与对CBF的诱导和激活是重要的。除此之外，实验证实机械力也会诱导CBFs的转录。接触或搅拌拟南芥植株后，CBF1/2/3会快速的诱导到平均水平或者高于寒冷诱导

16、的水平1。从CBF调控的多种方法中整合信息也许会提供给我们理解响应低温CBF诱导机制的合理解释。寒冷诱导中钙离子的参与证明是通过CRTs实现的。冈田酸处理能抑制4个CRTW贝报告基因的寒冷诱导21。冈田酸被证实可抑制钙离子的顺势急剧积累，但是对钙离子的缓慢积累没有影响，通过抑制蛋白磷酸酶活性来减少钙离子内流23。抑制含有4个CRTW贝的报告基因所需的浓度相对2c类型蛋白磷酸酶的抑制是特定的21o两个2c类型蛋白磷酸酶，ABI1和ABI2是作为拟南芥保卫细胞中控制钙离子内流的ABA信号下游的组成成分24。冈田酸对寒冷诱导的钙离子水平具体影响是未知的；然而，这个实验提升了钙离子通过CRT元件来激活

17、CBF靶基因的可能性。活性氧（ROS调节信号途径可能也对诱导CBFs具有重要作用。FRO1是一个线粒体呼吸链复合体1的脱氢酶亚基NADHfro1突变体中显示为RO延续积累25。fro1突变体对寒冷敏感，寒冷响应的转录子COR15a,COR47Kin和RD29a的诱导降低。这种降低导致fro1植株耐寒性下降。有趣的是fro1突变体增加的CBF水平与野生型相比，发现响应低温的CBF诱导在12小时时有了唯一变化。也许这表明活性氧信号参与了基于昼夜规律或光照的CBF表达。活性氧信号与钙离子信号之间存在广泛的交叉作用。例如，活性氧信号能够激活质膜Ca2嘀子通道通透性，而Ca2何以调控活性氧清除机制26,27。参与CBFs诱导的钙离子可能对理解CBF响应多种环境信号