血清白蛋白的分离

1、 生化大实验 学 院: 化学与生命科学 专 业: 生物技术 姓 名： 管宇 学 号: 09640129 血清白蛋白的分离、纯化与鉴定一.实验目的掌握血清白蛋白分离纯化的方法；学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质的原理与操作；学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；学习检测蛋白质纯度的方法；掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。二.实验原理1.血清白蛋白的初步分离血清白蛋白约占血浆蛋白总量的60%，水溶性很强，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在

2、医学临床及生物领域应用广泛。 可以根据不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分离及提纯各种蛋白质。盐析是广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就可以重新溶解。在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。奈氏

3、试剂是络盐K2HgI4加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐2.血清白蛋白的纯化离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。本实验采用的是DEAE纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素

4、层析柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、及球蛋白（血清白蛋白等电点为4 . 5 ，绝大多数，及球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的球蛋白、球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。3.血清白蛋白纯度及相对分子量的测定SDSPAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变

5、性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异；2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-Bx（MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。该法测定

6、蛋白质分子量的局限性：1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）。4.血清白蛋白含量的测定考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系

7、，故可以用于蛋白质浓度的测定。 三.实验步骤1血清白蛋白的初步分离（1）收集血清：取5 ml血液，4 ，3,000 rpm离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 ml至10 ml离心管，留0.1 ml （样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；（2）量筒量取9 ml底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断的摇晃或振荡，4 静置2 h；（底液为50 %的饱和硫酸铵溶液）；（3）4 ，3,000 rpm离心15 min，收集上清，留0.5 ml至1.5 ml （样2）离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；（4）用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（7-9滴，白蛋白的等电点），用量

8、筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积（0.11×V）；（5）逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），边加边振荡，4 静置2 h；（6）4 ，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解，留0.1 ml至1.5 ml离心管（样3 ） ，用于测定蛋白质含量和电泳；（7）将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4存在；（透析袋的制备：透析袋中部有不能碰，将两条用棉线扎紧）；（8）NH4的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，

9、加入5滴奈氏试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4存在，需继续透析；2血清白蛋白的纯化（1）装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）；（2）准备60100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零；（3）上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内；（4）洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵，用0.021.0molL醋酸醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行梯度洗脱，收集；记录出现

10、峰值的管号；保存样品。3血清白蛋白纯度及相对分子量的测定（1）胶的制备（SDS-PAGE)编号溶液名称12%分离胶4%浓缩胶130% Acr 0.8% Bis2.0ml0.33ml2pH 8.9 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.7 Tris- HCI-0.63ml410%SDS100ul25ul5TEMED2.5ul2.5ul610%AP50ul12.5ul7H2O1.65ml1.5ml总体积 约5 mL约2.5 mL胶的制备（PAGE)编号溶液名称12%分离胶4%浓缩胶130% Acr 0.8% Bis2.0ml0.33ml2pH 8.9 Tris -HCI1.25ml

11、-3pH 6.7 Tris- HCI-0.63ml    5TEMED2.5ul2.5ul610%AP50ul12.5ul7H2O1.75ml1.53ml总体积 约5 mL约2.5 mL（2）样品的处理： 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min，取出冷至室温。上样顺序：（1）标准蛋白；（2）收集的蛋白质溶液；（3）柱层析出现高峰的管号蛋白质溶液；加样量：20l.（3） 电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后改为100V进行电泳。（电极缓冲液：pH 8.3 Tris Gly）

12、（4）染色：脱色考马斯亮兰R-250，4h或过夜。（5）脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇=75：875：50）脱色2-6h。计算血白蛋白的相对分子量 ：logMW=k-bx（MW为分子量，x为相对迁移率，k、b均为常数）4血清白蛋白含量的测定编号0123456789101112131415161718标准蛋白00.20.40.81.21.62.0样液            水2.01.81.61.20.80.40    

13、        考马斯亮蓝5555555555555555555标准蛋白液：50µg/ mL 样液稀释样1 600倍 取50ul 样2 200倍 取50ul样3 400倍 取50ul 样4 40倍 取50ul按上表加好试剂后摇匀，以0管为对照，于595nm处测定光吸收值，做出标准曲线；各样品的光吸收值，取平均值，从标准曲线中查出蛋白质的µg数。 四实验结果2血清白蛋白的纯化管号读数管号读数管号读数管号读数管号读数142457479570319338252548489471319439362641

14、499372319540462735509273319645562831519174319754672928528875319866773026538676319992*873124548377311001289732235579*7831101168*10833235675793210216911103423577780321031651213352458668132104162131836255961823310515814243727604783331061541534383061408433107149164639356231853310814417574043633086341091

15、36186941596430873411012719754275653088341111122072*4384663089342166449067309036226545936830913723634694693092373. 血清白蛋白纯度及相对分子量的测定 SDSPAGE凝胶电泳图 非变性凝胶电泳图从左到右依次是标准蛋白，样1，样2 从左到右依次是样2，样3，样1，样4，样3，峰1（样4），峰2（样5），峰3（样6） 样5，样6 相对迁移率(迁移长度/总长度)0.9/3.81.3/3.81.9/3.82.7/3.83.4/3.8分子量9740066200430003100020100相对迁

16、移率0.2370.3420.50.710.8945logMV4.994.824.634.494.3相对迁移率和logMV的线性关系图：纯化蛋白的迁移长度为1.35cm,总长度为3.8cm,相对迁移率为0.355，代入上述方程LogMW=-1.0003*0.355+5.18296=4.83 得MW为67608,大小和牛血清蛋白的分子量相近。4.血清白蛋白含量的测定蛋白浓度（µg/ mL） 051020304050OD值00.0350.1520.2450.3250.3750.475 蛋白质浓度和595nm处的光吸收值图：样品的蛋白质浓度：将OD之代入上述的y值中求出相应的x值y=0.00

17、93x+0.0231，样1的0.198代入可得y为18.806，同样样2，样3，样4 ，样5，样6的OD值代入，可得如下表所示的数据。OD值x值*稀释浓度蛋白质浓度（µg/ mL） 样10.19818.806*60011283.6样20.22621.817*4008726.8样30.22421.795*2004359样40.21120.204*40808.16样50.21320.226*40809.04样60.2221.172*40846.88五实验讨论1血清白蛋白的初步分离这是本次实验较为简单而又是作为后续实验重要基础的的一部分，在血清白蛋白的初步分离中要注意对血红细胞的充分分离，

18、避免对后续的实验产生影响，如果在加入饱和硫酸铵后的离心结果中沉淀还呈红色，说明血红细胞还没有被完全分离。2.血清白蛋白的纯化在离子层析中，液滴的速度要注意是以通过核酸蛋白检测仪的液滴速度为准的，这是因为在洗脱液的流动过程中受到层析柱中的树脂以及核酸蛋白检测仪等阻力，一般以1ml/min的流速为宜。3. 血清白蛋白纯度及相对分子量的测定 从电泳图来看，由原先的多条电泳条带到最后的一条清晰的条带的确可以说明蛋白被逐步纯化。在SDSPAGE凝胶电泳图中，样1的最高处向下凹，而且条带呈圆形，极有可能是由于存在气泡造成的。在非变性电泳图中大致和SDSPAGE凝胶电泳图上的条带是一样的。但在样5处却无条带，对比于SDSPAGE凝胶电泳图，可以排除样5的含量低而造成电泳无条带，那么有可能是漏加样5，也即加的仅仅是缓冲液。此蛋白的相对分子量得大小为67608和牛血清白蛋白66200的大小相近，故更可以确定最后一个峰是血清白蛋白。4.血清白蛋白含量的测定在血清白蛋白含量测定的过程中，样1需要稀释的倍数是600而所需要的仅仅只有两毫升，为了方便量取