腺病毒中文操作手册

1、腺病毒中文操作手册r .rWa :Company number ：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998 腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册第一章简介1第二章应用重组腺病毒的优点2第三章AdEasyTM技术3技术概况3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒Ad V Adenoviral Vector 腺病毒载体AmpAmpicillin氨节青霉素BGaipGalactosidasep 半孔糖昔酶bpBasePair 碱基对BSABovineSerumAlbumin小牛血

2、清白蛋白cDNAComplementaryDNA 互彳卜 DNAcccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNACPECytopathicEffect 细胞病理效应CsClCesiumChloride 氯化 GDMEMDulbecco'sModifiedEagleNfediuinDMEM 培养基DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚飒DTTDilhiothreitol 二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide 漠化乙锭FBSFetalBovineSerum

3、 胎牛血清HrIIour 小时ITRInvertedTenninalRepeat 反向末端重复KanKanamycin卡那京素kbKilobases千碱基对KDaKiloDahons 千道尔顿第一章简介目录系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程4将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1LBLuria-Bertani(broth)LB 培养基MCSMultipleCloningSite 多克隆位点MinMinute 分钟MOIMultiplicityofInffection(Vinis/CeH)感染复数mRNAMessengerRNA 信使 RNAMWCOMOIecularWeigh

4、lCut-offPAGEPolyAcrylainideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit 空班形成单位 piPostlnfection 感染后RCAReplicalionCompeientAdenovirus 增殖性腺病毒 RITRRightlnvertedTenninalRepeal 右侧反向末端重复 SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠TBETrisBorale/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四 乙酸TCID50TissueCultu

5、reInfectiousDose5050% 组织培养感染剂 量TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白TETris/EDTATE 溶液wtWildType 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-4氯引喙QD 半乳犍昔当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗 体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和 治疗性的分析工具，为解决这一问题，基因输送技术（通常使用病毒载体如增殖缺陷的

6、腺病毒）通过基因工程不断发展，致 力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂:，1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现，迄今为止已发现了 40多种不同血清型和93种不同种类的腺 病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株,可在无 辅助病毒的情况下产生重组腺病毒(Graham等，1977) °此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得 到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域，迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读

7、者推荐 以下文章：Hillelal, 1999和Wiveletal, 1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白(Massieetai, 1998A.B) 0 但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重 组腺病毒试剂盒Adeno-QuesiTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病 毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞(Heetal, 1998),使获得重组腺病毒对任何有细胞培养 设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重

8、组蛋白。AdEasyTM转移载体 可允许插入的外源DNA,目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺 病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012Vp的操作步骤。AdEasyTM鼓体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部 试剂，所有成分购买后即可使用。第二章应用重组腺病毒的优点1 .宿主范围广.对人致病性低这套腺病毒数体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞 和组织中均可用来表达重组蛋白。2 .在增殖和非增殖细胞中

9、感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则 能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统， 它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3 .能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml,浓缩后可达1013VP/mI,这一特点使它非常适用于基因治疗。4 .无需辅助病毒，可容纳外源DNA：为提供克隆空间，此腺病毒缺失了 E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常 病毒DNA稍大的DNA分子(105%) o这些特点允许插入腺病

10、毒的基因或多基因表达盒可达。5 .与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折登 提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。6 .不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都 不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一 个较好的系统，7能在悬浮培养液中扩增：293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细

11、胞可在 l20L的生物反应器中表达重组蛋白。8.能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插 入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可 正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。第三章AdEasyTM技术技术概览在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA,同源重组则在大肠杆菌进 行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重 组载体的筛选更为简单，在本

12、系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用Pmel线性化，然后在大肠 杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了 E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞 中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切的进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用Pmel线性化，暴露其反向 末端重复序列(ITR, lavertedTerminedRepeals),转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对 于产生重组腺病毒至关重要，转移载体中的卡那

13、霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素 抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的 其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5a等进行 扩增,由于缺乏recA活性，DH5a不能用于腺病毒的同源重组。系统中产生重组腺病毒的时程与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重 组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5a中扩增后转入哺乳动物细胞293A,最后将293A细胞中

14、产生的重组病毒 颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖,一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，粤天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空 斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。我们强烈建议初学者用QBI-Infect +阳性对照进行感染力测定(见5.2.2第四章主要流程将基因克隆入AdEasyTM转移载体AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV,这2个教体都含有多克隆位点 (MCS)供插入基因

15、。pShuttle不含有启动子和多聚腺昔酸位点(polyA),允许插入含特定启动子和polyA位点的表达 盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle- CMV的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。表1 AdEasyTM转移戮体特性载体名称克隆能力启动子polyA位点克隆位点线性化位点说明MCS共转化位点Pmel (ECoRI)转染位点(Pad)将完整的表达盒装入多克隆位点(MCS)+MCS共转化位点Pmel (ECoRI)转染位点(PacI) CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白4.1.1克

16、隆的一般原则AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：1)在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在 pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切醐进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那 么必须进行定向突变。2)重组腺病毒质粒在转染QBI293A65U20分钟进行灭活。5 .凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线 性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号06 .重悬纯化的DNA,浓度至少

17、为ul。每个转化实验取lug进行，包括对照。细菌内AdEasyTM重组子的产生2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。4 .按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183, Bio.Rad仪器一般使用的参数为：2000hms、25uF、； BTX仪器则为： 5Ohmsv、C=0c5 ,用ImlLB重悬转化物,6 .转入1550疝离心管中，37C。震荡培养60分钟°7 .将转化物铺35块LB/Kan (50ug/ml)培养板：371将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构，比如：Pad酶切后通常得到约30kb的片段和一个或的小片段。小片段的大小 因重组位重在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切

18、酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重 组子转入DH5a中进行扩增：转化DH5a只需l-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需 的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5a中能很容易地获 得大量DNA。1 .将DHSa感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。2 .将L5U1DNA加入40U1DH5a感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。3 .将DHSa感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。4 .按照说明转化DH5a ： BibRad仪器一般使用的参数为：2000hms. 25uF、； B

19、TX仪器则为：50Ohms、C=Oc 5 .将转化混合液重悬于1MLB中。6 .转入15-50ml离心管中，37C。振荡培养60分钟。7 .培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5a （1:10、1:100和1:1000）8 .取1003转化液铺在LB/Kan （50ug/ml）板上，37co培养24小时。未用的转化液可在4co保存2周。9 .每个重组子挑13个克隆转入5HLB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切的再次分析重组DNA,以确证含有插 入基因，以及重组子的稳定性。10 .用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。11 .取5ug质粒用Pad消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无

20、菌条件下溶于xTE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章 中有关转染前DNA制备的内容q重组子转染QBL293A细胞注意：培养细胞前先参阅空中有关QBI293A293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达 到乂106。37co2M氯化钙溶液,上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ulAdVDNA溶液和26ul2M氯化钙，再用移液 枪慢慢吹打混匀。此时线冲液的体积为250ul,含有0.25M氯化钙和5ugDNA。3 .准备第2管离心管（编号2）,加入250ul2xHBS缓冲液。4 .用1ml移液枪吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。加完后继续吹打

21、5秒以使其完全 混匀，这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分钟后 再加入细胞培养皿内。5 .在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃 动培养皿使沉淀均匀分布。6 .培养皿放入孵箱培养过夜0 4小时后，沉淀颗粒在200x倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。7 .第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的ImMEDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁，清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿，用移液 枪反复将

22、培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8 .将细胞分装入4个60mm培养皿（每个培养皿中加5mlDMEM5%）或一块6孔板中（每孔加3mlDMEM5%）,静置6 小时使其贴壁。6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。第五章常用技术 细胞培养昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏 感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培 养34个月维持原有细胞特性,若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果

23、° 一旦到了 30代，最好复苏 一管细胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。QBI293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有LL葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰股和胎牛血清。 血清浓度为视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为DMEM后加血清浓度（如： DMEM5%表示：含有LL.笥萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。 QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细 胞。被感染的细胞则

24、变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE） o所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是 至关重要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。QBI293A细胞生长的相对密度见下表：表2 ：汇合率与细胞数量汇合率（%）60mm培养皿100mm培养皿 xx 106xx 106xx 1065.1.1QBI-293A细胞初始培养1 .将冻存的一管QBI-293A细胞在37C。水浴轻轻晃动融化。2 .融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。3 .将细胞转入15mL无菌离心管中，力口入lOmLDMEMIO%, 600xg离心5分钟使细胞沉淀。4 .弃去

25、上清c5 .将细胞用lOmLDMEMIO%重悬，轻轻打匀6 .转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。7 .在5%CO2解箱中37C0-293A细胞的维持培养和增殖QBI-293A-293A细胞的冻存建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%,以保证亚克隆的特定表型。-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。2 .将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。3 .以最小体积的DMEM10%重悬细胞,4 .用血球计数器进行细胞计数。5 .用DMEM5%+IO%DMSO+40%FBS重悬细胞，细胞终浓度为lxlO6/mLa6 .无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。7将

26、冻存管放入冻存盒中，-80C。储存24小时。这一简便措施可保持约1C。/分钟的降温速率，适于冻存细胞。8.第二天将冻存的细胞转入液氮推或-150C。冰箱中长期保存c QBI-293A细胞若正踊冻存，则可在液叙罐中保存数年。-293A细胞的感染和病毒空斑的产生感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如 滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了 QBI-293A细胞感染后不同时间的具 体变化。293A细胞QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞

27、接触后。被感染细胞的 表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI） o病毒控制细胞并阻止细胞的生长需 要几个小时的时间。当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完 整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感 染时达到100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE 而其余的细胞表现为原来未被感染的形态,感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初2小时感染

28、中最好将培养液的体积减到最小， 这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（）可使病毒分布更均匀，从而使 感染效果更好。注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是 一个线慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入 琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。第10天可以在光镜下看到形态完整的 空斑，有经验的

29、研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到14天，空斑可非常容易地被挑选出来。将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快 太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。琼脂糖/DMEM混合物制备：1 .用无菌PBS制备5%SeaPlaque琼脂糖（FMC产品）储存液，高压消毒后每管10mL分装在50mL塑料离心管中，4C。保 存。2 .使用之前先在微波炉中融化5%SeaPlaque琼脂糖避免沸腾），然后冷至45C°。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴 中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉

30、中加然数秒。3,加入30mL预平衡至37C。的DMEM5%后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为%。立即使用。覆盖QBI-293A细胞：在进行下一步操作之前，谙确认细胞是否已贴壁完好。1 .移去培养液，用%琼脂糖/DMEM混合物覆盖单层细胞。2 .沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表3,然后放回CO2孵箱培养。表3 ：不同培养器皿应用的琼脂糖体积培养皿大小首次量追加量100 mm 10mL5 mL60 mm5 mL3mL6孔板空斑应在1皿21天内形成，为保持细胞活力，每45天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM混合物。酶这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量（精确测定病毒颗粒数

31、蚩见节的滴度测定）。MOI测定通常在扩增病 毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。这一实验可在含有1X106QBL293A细胞/孔的6孔板中进行。1 .移去培养液，每孔加入500HL新鲜的培养液2 .一孔为对照，其余每孔分别加入2、5、10、25、50gL病毒上清。3 .不断缓慢晃动培养板，培养约3小时。4 .加入新鲜培养液培养72小时。观察每孔细胞是否出现CPE,根据预先的估计，感染后3天细胞完全出现CPE的病毒MOI值为1020。这样，根据感染 的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。| 腺病毒感染力测兔这一实验的目的是确定腺病毒是否能将DNA转导入293之外的某一细胞株。

32、该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否 可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。这个实验 中，如果用的是Ad5-CMV-LacZ则检测小半乳糖甘酶,Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP则检测GFP。这些高滴度的产 品都可单独向昆腾公司购买，本实验的阳性对照（但半乳糖昔酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而不适 于直接进行实验，通常需要扩增以达到理想的病毒滴度（扩增步骤见）。腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样，其中尤以淋巴细胞株最难转导:，腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行，MOI为1200,当测定淋巴细胞株时MOI

33、可至1000。对大多数细胞株来说， 15。的MOI值可将报告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高MOI情况下，某些病毒蛋白的高表达可对某 些细胞产生毒性。无论MOI为多少，感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动，以使感染效果达到最佳。1 .按521C°预热的PBS冲洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆盖细胞，戊二醛室温孵育515分钟 或2%多聚甲醛室温孵育60分钟。2 .弃去固定液，室温下用PBS彻底洗3遍：第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留5分钟。3 .加入最小体积的X-gal溶液。U蜉育1至12小时（过夜），阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后

34、可将培养板置于4C。保存。溶液：a）戊二醛固定液使用前将戊二醛用PBS稀释至终浓度为%。b）多聚甲醛固定液1 .将2g多聚甲醛溶解在50mL预然至55C。的水中。2 .加入2滴lONNaOH,溶液将变澄清。3 .待多聚甲醛溶解后，加入磷酸二氢钠（100mL）和磷酸氢二钠（无水，3g/100mL） 04 .固定液在37C。条件下加入，在室温下固定。多聚甲醛固定液可在4C0最长保存一个星期，c） X-gX溶液用PBS制备（）：20mM 粗铁酸钾（K3Fe（CN）6）20mM 粗亚铁酸钾（K4Fe（CN）63H20）2mMMgC12 或 MgS04使用前加入Xgal储存液（20mg/mL溶于N.N-

35、二甲基甲酰胺），终浓度为Img/mL。上述三种X-gal染色用的溶液可在室温下保存数月，溶于N.N-二甲基甲酰胺的X-gal储存液则可于-20C。在玻璃容器中储 存，用箔包裹后避光保存。重组腺病毒的筛选和纯化恢4：各种筛选方法的特性筛选方法优点缺点Western杂交显示表达蛋白的完整性显示插入基因的蛋白表达水平需要表达蛋白的抗体可以用与其它蛋白有交叉反应的抗体，因为蛋白会在胶上得到分离得到最终结果需两个星期Southern 杂交或点杂交使用克隆基因作为探针，无须特殊试剂通过信号强弱间接测定粤个细胞内的病毒数量需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间仅能检测克隆的基因PCR迅速，使用扩增病

36、毒的储存液只需I天时间仅能检测克隆的基因且无法定量可能需要优化克隆基因的PCR条件免疫测定相对快速，总共需要3天时间需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体显示插入基因的蛋白表达水平功能测定直接显示蛋白的完整性和功能需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间对于大多数方法来说，信号密度与蛋白的表达水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的纯度有关。空斑总量中的阳 性率提示克隆的纯度高低。比较不同克隆间的信号密度水平时克隆的纯度非常重要，也就是说必须保证所有筛选出来的空 斑必须100%阳性。5.5.2病毒空斑挑选和小量扩增通过AdEasyTM系统纯化得到的细菌克隆而产生的病毒空斑应该几乎都是（9

37、5%）重组病毒。骞个细菌克隆最好测定至少 12个空斑的表型。操作步骤1 .从培养板上挑选612个空斑，标上圆圈。2 .无菌条件下用200叱枪头挑出克隆并转入含/孔的24孔板。C。病毒24小时,4 .铺一块每孔含1X105QBI-293A细胞的24孔板。5 .移去培养液，轻轻加入100卜工步骤3中清洗的病毒（约103病毒颗粒），切勿将细胞吹起，十字型轻轻晃动3次，转入 CO2解箱37C。培养90分钟,6 .力口入DMEM5%,使总体积为1mL,轻轻混匀。UCO2孵箱培养直至完全出现CPE,在此MOI值下一股需要510天。如果10天后还没出现CPE,说明此克隆的病毒量 太低，需要进行第二轮犷增，8

38、 .为从细胞中释放病毒，在-20C。和37co中充分冻融细胞3次。9 .收集细胞，在15mL离心管中打碎。台式离心机上以最大转速离心10分钟，收集上清并储存于-80C：这一冻存液中大 约有5xlO7VP/mL.如步骤7中所述，如果在第一次扩增后CPE不完全，则进行第二轮扩增。由于QBI-293A细胞含有腺病毒基因组的El区，因此E1区缺失的腺病毒与人染色体发生同源重组而产生有增殖能力的腺 病毒(RCA)的机率很低。发生这种回复突变的机率大约为1/107,这种朦病毒的增殖速度比重组腺病毒快。首轮扩增产 生的腺病毒保存液是十分重要的，因为它含有RCA的可能性最低。这种保存液必须节约使用，并保存好所

39、有低代病毒， 以便进行大量扩增，不可用已传过数代的病毒进行大量扩增，低代病毒DMEM5%溶液可在-80C。条件下保存数年。所 以，保存好低代病毒可避免进行重复筛选和纯化病毒克隆的工作，在这一期间可以选择适当的方法来筛选重组病毒，当所有病毒空斑100%为正确的重组病毒时可以认为这个克隆为纯的。 如果此时病毒仍然不纯，则可以进行第二轮空斑纯化，然后再用适当方法进行筛选。以下内容提供了进行Western杂交的一般指导，按照本手册制备的初次病毒扩增保存液已足够用来检测大多数腺病毒蛋 白，SDS-PAGE、抗体反应和检测系统的具体操作请参考标准实验手册c1 .在5x105细胞/孔的24孔板中每孔加入5O

40、OMLDMEM5%培养液，然后再每孔加入200ML初次病毒扩增保存液感染48小 时。2 .确证所有细胞均出现CPE,如果CPE不完全则再延长感染24小时c3 .取出400卜工转入试管中，其余80UC。孵育2小时。5 .加入5MNacl储存液至终浓度为1M。6 .冰浴3小时以上，或4C。过夜。7 . 14000xg4C°o4.800rpm离心5分钟，弃上清，将沉淀用20WPBS重悬，用P20移液器使细胞充分混匀，重悬，此时，可按照能保留蛋白功能的操作方法提取蛋白。注意，细胞抽提物含有大量病毒DNA,从而会提高溶液的粘滞度。 如果粘稠性影响操作，可用超声降解DNA或用20G针头将DNA打

41、碎。但细胞浆抽提物则不存在此问题。对于DNA结 合蛋白，蛋白功能测定通常是观察其迁移，对某些酶则进行比色测定。病毒颗粒在QBL293A细胞中的大应隔一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的 基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3x101 l3xl012,由于一个细胞中所含的病毒颗粒为100010000,因此1L 培养细胞可得到约5x1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化徒梯度离心纯化，则必须至少3x108的细胞，这样才能正确分 辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步犷增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方

42、法进行蛋白抽 提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程，粤个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果 由于各种琮因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次犷增都将会剩下一些病 毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可 能性会大大降低。操作步骤：1 .在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10MDMEM5%培养5xl06QBI293A细胞。2,取首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml,混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。3.移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细

43、胞单层，十字形慢慢免动3次，37UCO2解箱中培养90分钟。4,力口入 9MDMEM5%。5.再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5xl095xl010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒0。如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定0 o收集细胞，600xg离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最 小体积(一般为原始体积的1/10即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-20C737co冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去 除细胞碎片，收集上清，然后按进行病毒滴定。C。/37co冻融3次。7,转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟,收集上清冻存于20C。或-80C

44、0。个175cm2培养瓶中各加入107QBL293A细胞进行培养°9 .将3ml细胞裂解液上清加入12mlDMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，等瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混 匀3次，37coe02蜉箱中培养90分钟。此时MOI值约为25。10 .加入 DMEM5%至 30ml。1L再培养4872小时。此时10ml培养液病毒量约为3xl010<bd011。若需要，进行MOI测定()以估计病毒滴度， 此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤（）。600xg离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶 液重悬细胞。-20C0/37C°冻融3次，台

45、式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，按章中所述进行病毒滴定。12 .移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。13 . 30瓶175cm2培养瓶中每瓶各加入107QBL293A细胞。14 .将45ml细胞裂解液上滑加入1O5MDMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml混合液感染细胞，十字形缓慢 晃动3次混匀，37C。培养90分钟。此时MOI值约为25。15 .力口入 DMEM5%至 30nW瓶。16 .再培养4872小时，此时约有3x10143x1012个病毒。若需要，进行MOI测定估计病毒滴度,如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5WD

46、MEM5%中。20U/37C。冻融3次，离心沉淀细胞碎片。此时 5mlDMEM5%中3x1011Axi012个病毒颗粒，浓度为6xl0106xl01然后按章中所述滴定病毒储存液，或者用标准的氯化铅密度梯度离心法纯化病毒。在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用 来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量,如果已没有纯化的空 斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的 病毒作为扩增源。比如，用第2代病毒产生第3代病毒。如

47、果没有第2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代 病毒。按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取l-5n唱蛋白，建议 在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大蚩扩增蛋白。依5 :腺病毒扩增两次氯化铅密度梯度离心纯化重组腺病毒3腺病毒纯化包括3步：1 .不连续氯化钳密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒C2 .连续氯化相密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。3 .透析去除氯化铅（去盐）。连续密度梯度需要过夜离心，为保证时间安排，建议从早上开始第1步，这样大约在午后就

48、可开始过夜离心。按照此时间 安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约需2天时间。下面所有操作均以SW28转子30ml离心管为例。理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在离心后收 集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的离心管中，病毒带更 细，离原始位置更远，这样，病毒带在30ml离心管中比在12ml的管中更易分辨。5.5.7不连续密度梯度离心注意：为确保氯化铅密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3x108细胞。1 .预冷离心转子至4C°。2 .在离心管中级慢加入8mli.4g/ml氯化铅（53g+87mll0inMT

49、rz-HCL,）,再非常轻缓地加入6mli.2g/ml氯化铅 +92mll0mMTris-HCL, ） 0病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。3 .超净台中在不连续梯度顶部加入20NDMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯 度负荷量。如果保存液的体积少于20ml,用10mM调至20ml04 .平衡离心管，lOOOOOxg （SW28转子上为23OOOrpw） 4c。离心90分钟。5 .超净台中取出席心管，用夹子直立固定离心管。6 .用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。7 .在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿剌过程中有液体泄露。8 .用带18Gl.

50、4g/ml和14mlL2g/ml氯化铅连续密度梯度加入离心管中。3 . lOOOOOxg4co离心 16-20 小时04 .超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒 带。溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。5 .用10ml移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒 时降低溶液流出速度。6 .用20G10mMTris （） , 2mMMgcl2, 5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至1013vp/ml,并且具有良好的稳定性。 （Nybe

51、rg-Hoffman 等,1999）。将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4C。透析，去除氯化铅盐。由于病毒分子量较大，大小约90nm, 因此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换辍冲液，3次更换辍冲液后应已 无痕量氯化钳。透析后的病毒溶液可在-80C。中长期保存，-20C。中则可保存较短时间。需要注意的是腺病毒在反复冻融后 感染力招成弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（：病毒滴度测定），剩下的用于以后的实验，如果透析 后病毒溶液太稀，Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍，这个过程中所丢失的病毒量小于10%。

52、纯化柱在 使用前必须用70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒线冲液）。病毒滴度冽定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。1 . VP （病毒颗粒）或OPV （光学颗粒单位）2 .GTU （基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3 . PFU （空斑形成单位）4 . TCID50 （50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50） 01 .测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA） , I个OD值相 当于X1012个

53、病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此 这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。2 .GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即洌J 定表达报告基因的细胞,如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不 用这种方法来进行描述。3 .PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周 期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其

54、它实卷室重复，即使在同一实验室内， 不同技术员操作也很少能得到相同的结果，4 . TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测 每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体 间也更稳定。所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存 液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一 种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mi

55、ttereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培 养板进行离心（1000RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997） 0这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的 方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。所有结果都只是大概的，目 前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏 感性、易用性和耗时

56、。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得 到的病毒保存液的滴度应为：106107第一代细胞经冻融后108To9100倍数量的细胞经过冻融后10101011用氯化徒方法纯化后表6 ：各滴度测定方法特性方法类型时间可重复性滴度*评注VP物理学方法2小时好5x1012GTU生物学方法2天可变2x1011PFU生物学方法21天变化很大5x1010传统方法TCID50生物学方法10天可变X1011昆腾公司标准方法*以VP法测得的5x1012的病毒保存液为标准5.8.1这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为X1012/OD260单位c由于大多

57、数分光光度计在OD值小于时不够 精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果OD值大于，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于 测定氯化铅纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷 性颗粒。1 . 4C。融化病毒保存液。2 .在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB） （%SDS, , ImMEDTH）准备二个病毒稀祥度。最小需要量为：病毒裂解液病毒稀释度52ul52ull ： 2 （稀释液 1）168ul42ull ： 5 （稀释液 2）注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1 ： 10和1 ： 20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD值在之间。3 . 56C。震荡培养10分钟。4 .准备1ml含有VLB和透析线冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。5 .测定260nm处吸光值：稀释液1再稀释1 ：5,为稀释液3。稀释液2再稀释1 ： 5和1 ： 10,分别为稀释液4和稀释液50测定稀释液5 （2次）、4、3的OD260,取此