HPV基因分型检测及临床意义-苏桂华

1、HPVHPV基因分型检基因分型检测及临床意义测及临床意义主讲者：苏桂华 人类乳头瘤病毒（人类乳头瘤病毒（Human PapillomaHuman Papilloma virus virus，简称简称HPVHPV）是一种嗜上皮性病毒，有高度的）是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。长期以来，已知特异性。长期以来，已知HPVHPV可引起人类良可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。像乙肝病毒一样，在粘膜上的乳头状瘤。像乙肝病毒一样，HPVHPV也是一种也是一

2、种DNADNA病毒。病毒。 HPV是一种性传播微生物。它能通过皮肤或黏是一种性传播微生物。它能通过皮肤或黏膜的微小损伤，进入接触者的皮肤黏膜，膜的微小损伤，进入接触者的皮肤黏膜，HPV刺激表皮基底细胞，产生分裂，使表皮产生增刺激表皮基底细胞，产生分裂，使表皮产生增殖性损害。在殖性损害。在1954年，年，HPV便被证实是性传便被证实是性传播疾病的病原之一，与泌尿生殖系尖锐湿疣有播疾病的病原之一，与泌尿生殖系尖锐湿疣有关，并具有传染性。关，并具有传染性。 HPV引起宫颈癌的机制复杂。病毒引起宫颈癌的机制复杂。病毒DNA与宿与宿主染色体的整合，主染色体的整合，HPV E6、E7蛋白的异常表蛋白的异常

3、表达，以及癌基因、端粒酶等都参与其中。达，以及癌基因、端粒酶等都参与其中。p HPV HPV感染有高危型和低危型。所谓的高危感染有高危型和低危型。所谓的高危型就是说这种人比较容易导致宫颈癌。如果感型就是说这种人比较容易导致宫颈癌。如果感染的是低危型的染的是低危型的HPVHPV，将来可能导致宫颈癌前，将来可能导致宫颈癌前病变，或者尖锐湿疣这一类病变的可能性比较病变，或者尖锐湿疣这一类病变的可能性比较大 ， 导 致 癌 的 可 能 性 相 对 小 一 些 。大 ， 导 致 癌 的 可 能 性 相 对 小 一 些 。p 根据致病力强弱，根据致病力强弱，HPVHPV被分为高危型和低被分为高危型和低危型

4、两种，危型两种，“是否能致癌是否能致癌”是危险度大小的主是危险度大小的主要标志。国际癌症研究协会（要标志。国际癌症研究协会（IARCIARC）资料表明，）资料表明，1313种低危型种低危型HPVHPV主要引起生殖道、肛门周围皮主要引起生殖道、肛门周围皮肤等湿疣类病和低度子宫颈上皮内瘤变；肤等湿疣类病和低度子宫颈上皮内瘤变；1515种种高危型高危型HPVHPV，尤其是，尤其是1616和和1818型，主要导致高度型，主要导致高度子 宫 颈 上 皮 内 瘤 变 和 宫 颈 癌 的 发 生 。子 宫 颈 上 皮 内 瘤 变 和 宫 颈 癌 的 发 生 。 按感染部位分类按感染部位分类上皮型上皮型 HP

5、V1,5,8,14,20,21,25,47型 黏膜型黏膜型 HPV6,11,16,18,31,33,35,39, 41,45,51,52,56,58,59,68,70型 按发癌性分类按发癌性分类低危险群 HPV6,11,41,42,43,44型 高危险群 HPV16,18,31,33,35,39,45, 51,52,56,58,59,68,70型 目前，PCR实验室采用 来检测HPV分离法分离法检测分离法检测HPV的主要原理的主要原理 利用细胞裂解液使细胞膜破裂，利用细胞裂解液使细胞膜破裂，染色体染色体DNA和蛋白质变性，再利用和蛋白质变性，再利用某些有机溶剂抽提取使核酸分离或某些有机溶剂抽提

6、取使核酸分离或使核酸吸附于某些颗粒表面，再进使核酸吸附于某些颗粒表面，再进行 沉 淀 ， 从 而 获 取 核 酸 。行 沉 淀 ， 从 而 获 取 核 酸 。样本要求样本要求下生殖道分泌物、下生殖道分泌物、宫颈脱落细胞等样本宫颈脱落细胞等样本实验过程应穿着专用工作服和使用一次性手套实验过程应穿着专用工作服和使用一次性手套实验前应该对实验室进行紫外线消毒，并用实验前应该对实验室进行紫外线消毒，并用75%75%乙醇清洗工作台和微量加样器乙醇清洗工作台和微量加样器实验所用移液器（加样器）的移夜吸头不应重实验所用移液器（加样器）的移夜吸头不应重复试用复试用操作人员应受过专业培训或具有一定操作经验操作人

7、员应受过专业培训或具有一定操作经验使用一次性用品使用一次性用品取取500l 500l 混匀的临床标混匀的临床标本，加入本，加入1.5ml1.5ml离心管离心管14000rpm 14000rpm 离心离心1min1min100 15 min100 15 min加入加入400l400l溶液溶液，混匀，放置混匀，放置2 min2 min14000rpm 14000rpm 离心离心5 min5 min加入加入400l400l溶液溶液（预（预先溶解），重悬细胞先溶解），重悬细胞去上清去上清14000rpm 14000rpm 离心离心1 min1 min去上清去上清去上清，务必去干净去上清，务必去干净室温

8、放置室温放置5 min5 min晾干晾干加入加入60l60l溶液溶液重新悬浮沉淀，重新悬浮沉淀，充分溶解。加样前充分溶解。加样前14000rpm14000rpm离心离心5 min5 min，上清即，上清即DNADNAPCRmix PCRmix 提前解冻；提前解冻；TaqTaq酶使用时拿出冰箱酶使用时拿出冰箱在洁净离心管中按比例在洁净离心管中按比例混合混合PCRmixPCRmix、TaqTaq酶，混酶，混匀，短暂离心匀，短暂离心24l/24l/管管 分装到分装到PCRPCR管管将临床样本将临床样本DNADNA（1l1l）按）按相应顺序加入到各相应顺序加入到各PCRPCR管管标记各管，混匀，标记各

9、管，混匀，短暂离心短暂离心各管放入各管放入PCRPCR仪，仪，按程序扩增按程序扩增95 9 min95 9 min，（，（ 95 30 sec 95 30 sec ， 55 30 55 30 secsec， 72 30 sec 72 30 sec ）40 Cycles 40 Cycles 72 5 min72 5 min，4-16 Incubation4-16 IncubationPCRPCR仪需热盖加热（若无热盖，需添加石蜡仪需热盖加热（若无热盖，需添加石蜡油）；油）；PCRPCR产物可于产物可于44或或-20-20保存备用保存备用准备：水浴锅，准备：水浴锅，4545，杂交，杂交液，溶液液，

10、溶液B B预热；制备冰水预热；制备冰水PCRPCR产物：产物：PCRPCR仪仪/95/95变性变性5 min5 min迅速放入冰水中迅速放入冰水中开杂交仪，蒸馏水充满反应室开杂交仪，蒸馏水充满反应室开泵，排出多孔板上的水，关泵开泵，排出多孔板上的水，关泵安放安放 分隔膜分隔膜- -杂交膜杂交膜- -分隔室分隔室- -压压扣盖，杂交液扣盖，杂交液0.8 ml0.8 ml，预杂交，预杂交开泵开泵- -排干杂交液排干杂交液- -关泵，加杂交液关泵，加杂交液0.5 ml0.5 ml开泵：导流杂交开泵：导流杂交4545杂交液杂交液0.8 ml0.8 ml清洗三次，设温度清洗三次，设温度25 25 加封阻

11、液加封阻液0.5 ml0.5 ml，排液尽，关泵，排液尽，关泵（液体排尽后，在清洗下一次）（液体排尽后，在清洗下一次）20l PCR20l PCR产物：加入各反应槽杂交液中，杂交产物：加入各反应槽杂交液中，杂交（枪头吸吹（枪头吸吹2-32-3次混匀枪头勿戳破杂交膜）次混匀枪头勿戳破杂交膜）15 min15 min4545加封阻液加封阻液0.5 ml0.5 ml，封阻，封阻（封阻液少时在补加！）（封阻液少时在补加！）5 min5 min开泵开泵- -排液尽排液尽- -关泵；加关泵；加 酶标液酶标液0.5 ml0.5 ml：酶标：酶标（待温度至（待温度至252533后，再加酶标液）后，再加酶标液）

12、3 min3 min开泵开泵- -溶液溶液A 0.8 mlA 0.8 ml清洗四次清洗四次- -设温度设温度36-36-排液尽关泵排液尽关泵（清洗第二次时设温度（清洗第二次时设温度3636） 加显色液加显色液0.5 ml0.5 ml，盖好杂交仪盖板；显色，盖好杂交仪盖板；显色5 min5 min开泵开泵- -加溶液加溶液 B 0.8 ml B 0.8 ml 清洗三次清洗三次- -加蒸馏水清洗加蒸馏水清洗1 1次次- -关泵关泵结果判读结果判读1、宫颈病变及宫颈癌的筛查、宫颈病变及宫颈癌的筛查不同型别致癌能力不同，通过分型检测，对患者进行个体化评估，预测宫颈病变发生的风险度，从而决定筛查的间隔、治疗方案的制定。2、未明确诊断意义的非典型鳞状细、未明确诊断意义的非典型鳞状细胞和腺细胞（胞和腺细胞（AS-CUS/AGUS）和宫颈上皮内低度病变（和宫颈上皮内低度病变（LSIL）的分流的分流HPV基因分型检测可排