不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症的影响的研究(一)

1、不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症的影响的研究(一)    作者：李鸿佳, 王淑娟, 李艳丽, 董亮【摘要】 目的: 研究不同剂量脂多糖（LPS）通过诱导肺泡巨噬细胞（AM）Toll样受体4（TLR4）的高表达, 探讨其对哮喘小鼠肺部炎症的影响。方法: BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组（OVA）A, 低剂量LPS处理组（0.1 mg/L LPS+OVA）B, 高剂量LPS处理组（100 mg/L LPS+OVA）C, 对照组（生理盐水）D。用卵白蛋白（OVA）致敏与激发建立小鼠哮喘模型; 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液（

2、BALF）上清中IL4、 IL5、 IL13和IFN的含量, 实时荧光定量PCR法测定AM的TLR4的表达, 光镜观察肺组织病理变化。结果: 与A组相比较, B组BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平显著增高（P0.05）, 而IFN差异无统计学意义（P>0.05）, C组BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平显著降低, IFN显著增高（P0.05）; 与A组相比, B组与C组AM的TLR4mRNA表达均明显增高（P0.05）, 两组间差异无统计学意义; 光镜下, A组支气管黏膜下水肿, 黏液腺增生, 可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润。B组与C组上述情况未见减轻,

3、 并出现肺泡腔及间质充血, 中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润, D组管腔内无黏液栓, 气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整。结论: 低剂量LPS(0.1 mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达, 使肺部炎症加重, 而高剂量LPS(100 mg/L)可能会减轻变态反应症状。 【关键词】 肺泡巨噬细胞; 脂多糖; Toll样受体4; 支气管哮喘支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病1, 其发病率呈逐年上升趋势, 室内灰尘, 革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用存在很大的争议。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌的一类重要的病原体微生

4、物成分, 研究发现, LPS浓度可影响Th1/Th2炎症反应。高水平LPS可使具有抗原特异性的Th1反应增强, 低剂量LPS可使Th2敏感性增高, 提示LPS可能在过敏性炎症反应中具有独特的双向作用2。TLR4是LPS的主要模式识别受体, TLR4结合LPS等病原体相关分子模式后通过释放细胞因子可促进Th1细胞分化, 从而可能在哮喘免疫和宿主保护中起重要作用, 但目前尚没有足够证据证明TLR4能直接识别Th2型免疫应答。我们试图运用不同剂量LPS干预小鼠哮喘模型, 研究LPS诱导AM表面TLR4激活机制, 探讨TLR4激活在哮喘发病机制中的信号转导途径, 进一步明确其在哮喘小鼠气道炎症加重的机

5、制中的作用。1 材料和方法1.1 材料 鸡卵蛋白（OVA, Grade, 纯度98%, Sigma）, 超纯脂多糖(ultrapure LPS, Ecoli O111: B4, Sigma), BALB/c小鼠(68周龄, 雌性)由山东大学试验动物中心提供, 小鼠IFN和IL4 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司, 小鼠IL5和 IL13 ELISA试剂盒购自上海西唐生物公司, 总RNA抽提与纯化试剂盒购自Roche公司, SYBR Green 购自Roche公司, Spector型酶标分析仪（美国）。1.2 方法2 结果小鼠哮喘模型造模成功, 出现明显的烦躁不安, 呼吸急促, 腹肌抽搐,

6、大、 小便失禁, 毛发竖起, 部分小鼠出现反应迟钝, 动作迟缓; 而生理盐水对照组小鼠无明显异常表现。2.1 小鼠肺组织病理学改变 高倍显微镜下观察可见, A组支气管黏膜下水肿, 黏液腺增生, 黏膜皱褶增多, 黏膜及黏膜下层、 平滑肌外均可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润, B组与C组上述情况未见减轻, 并出现肺泡腔及间质充血, 中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润, D组气道上皮无增厚, 气道周围无炎症细胞浸润, 肺泡壁结构完整（图1）。图1 肺组织病理切片（HE染色, ×400）2.2 小鼠BALF细胞因子水平的检测 A组肺泡灌洗液上清中IL4、 IL5、 IL13和IFN的水平

7、显著高于D组（P0.05）; 与A组相比, C组IL4、 IL5和IL13水平显著降低, IFN水平显著升高（P 0.05）, B组IL4、 IL5和IL13水平显著增高（P0.05）, 而IFN差异无统计学意义（表1）。表1 BALF中IFN、 IL4、 IL5和IL13含量2.3 小鼠AM中TLR4mRNA的表达情况 与A组相比, B组与C组TLR4mRNA表达能力显著增强（P0.05）, 而D组与A组TLR4mRNA表达能力差异无统计学意义（表2）。表2 AM中TLR4mRNA的荧光域值循环数3 讨论哮喘的主要特征是慢性气道炎症和气道高反应性, 其发病及演变主要受控于Th2型细胞分泌的细

8、胞因子1。室内灰尘, 革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用存在很大的争议, LPS是革兰氏阴性细菌的一类重要的病原体微生物成分, 近年来TLRs的发现为机体对LPS的免疫应答提供了新的线索2。AM是一类重要的抗原提呈细胞, 其表面的TLR4作为LPS的主要跨膜受体, 介导了肺部的炎症反应, 首先形成的LPS/LBP/CD14复合物, 在MD2的辅助下, 通过接头蛋白MyD88（myeloid differentiation protein, 髓样分化蛋白）, 使IRAK(IL1 receptor associated kinase, IL1受体相关激酶)、 TRAF（TNF recep

9、tor associated factor, 肿瘤坏死因子受体相关因子）6、 MAPKKK(MAPK kinase kinase)家族依次活化, 从而激活NIK（NFB诱导激酶）、 IKK（IB激酶）, 使NFB解除抑制入核转录3, 4; TRAF6还可通过激活MAPKKK、 MAPKK、 ERK、 P38和JNK/SAPK通路, 最后导致转录因子AP1家族的成员jun和fos活化5, 进而诱导各种炎症因子如TNF、 IL1、 IL6等大量释放, 加重了肺部炎症。我们通过建立不同浓度LPS预处理的哮喘小鼠模型, 发现两组LPS预处理的小鼠, AM的TLR4mRNA表达与哮喘模型组相比均明显增强

10、, 而不同剂量LPS处理的哮喘小鼠之间, AM的TLR4mRNA表达差异并无统计学意义, 提示我们AM的TLR4是LPS引起免疫应答的主要受体, LPS可诱导哮喘小鼠AM的TLR4mRNA的表达上调, 而OVA并不能刺激TLR4mRNA表达增强, 这与Eswarappa等7的研究相一致。同时发现LPS暴露水平可以决定机体产生炎症反应的类型6, 暴露于含高浓度LPS（100 mg/L）的OVA的小鼠, 其气道的变态反应症状减轻, 主要以中性粒细胞浸润为主, 粘液分泌不明显, Th1型细胞因子IFN明显增加, 主要与肺损伤有关; 而暴露于含低浓度LPS（0.1 mg/L）的OVA的小鼠, 其哮喘症

11、状加重, 肺部以嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润为主, 粘液分泌增加, 抗原特异性Th2型细胞因子IL4、 IL5和IL13明显增加8, 这使得卫生学假说对于内毒素的暴露使Th平衡向着减弱Th2型的方向发展的理论, 在哮喘的发病机制中还需进一步深入研究, 我们推测这可能与重症哮喘以及哮喘的急性发作密切相关, 这有待于我们试验的进一步探讨与证实。【参考文献】1 Goetzl EJ. Changing paradigms in the immunological science of allergy: 2008J. Curr Allergy Asthma Rep, 2008, 8(1): 28-31.

12、2 Hollingsworth JW, Whitehead GS, Lin KL, et al. TLR4 signaling attenuates ongoing allergic inflammationJ. Immunol, 2006, 176(10): 5856-5862.3 Noulin N, Quesniaux VF, SchnyderCandrian S, et al. Both hemopoietic and resident cells are required for MyD88dependent pulmonary inflammatory response to inh

13、aled endotoxinJ. Immunol, 2005, 175(10): 6861-6869. 4 Chen F, Du Y, Zhang Z, et al. Syntenin negatively regulates TRAF6mediated IL1R/TLR4 signalingJ. Cell Signal, 2008, 20(4): 666-674.5 Koch A, Knobloch J, Dammhayn C, et al. Effect of bacterial endotoxin LPS on expression of INFgamma and IL5 in Tlym

14、phocytes from asthmaticsJ. Clin Immunol, 2007, 125(2): 194-204. 6 Celedon JC, Milton DK, Ramsey CD, et al. Exposure to dust mite allergen and endotoxin in early life and asthma and atopy in childhoodJ. Allergy Clin Immunol, 2007, 120(1): 144-149.7 Eswarappa SM, Basu N, Joy O, et al. Folimycin (concanamycin A) inhibits LPSinduced nitric oxide production and reduces surface localization of TLR4 in murine macro