基因克隆和基因体外表达研究生

1、基因克隆和基因体外表达研究生2 基因克隆是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节元件（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。 3 第一节 基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶（restriction enzyme） 它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。4 52限制性内切酶的命名 EcoR E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株63限制性内切酶的识别和切割位点 通常是46个碱基对

2、、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3黏性末端（sticky end）。 如EcoR切割后产生5黏性末端7Pst切割后产生3黏性末端：有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Blunt end）, 如Sma：8二、其他常用的工具酶1. DNA聚合酶 (DNA polymerase I) 有聚合酶活性 有35核酸外切酶活性 有53核酸外切酶活性 91011122. DNA聚合酶大片段 DNA聚合酶大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的

3、大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 有53聚合酶活性有35核酸外切酶活性 无53核酸外切酶活性13Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3末端。14(2) 通过补齐3端，使3末端标记。 5-G-OH Klenow 5-GTT*A*A-OH 3-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3-CAA T T-OH(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。(4) DNA序列分析。153. 逆转录酶（reverse transcriptase） 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA， 合成方向为53延伸，无35外切酶活性。

4、用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。 16174. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。 18195. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。2021 6. 末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。它的作

5、用是将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 2223 第二节 基因克隆的载体 一、常用的克隆载体(一)质粒（plasmid） 质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。 24作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。 25262728 质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。29(

6、二)噬菌体 噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是噬菌体，另一种是M13噬菌体。 野生型噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。 30 31 gt10和gt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 gt11为表达型载体。32Ziplox载体33(三)黏性质粒（cosmid） 黏性质粒是由噬菌体的噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容

7、量可达4050kb。 34(四) M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。35 当每个细菌体内的复制型M13拷贝数积累到100200后，M13的合成就变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量的单链DNA，并被包装到成熟的噬菌体颗粒中，然后从细菌中排出。M13噬菌体的最大优点在于从细菌体内释放出的颗粒中所含的单链DNA。3637(五) 病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒

8、启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。38二、表达载体(一) 原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和转录终止信号.3940(二) 真核表达载体 载体中含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、 转录终止信号和poly (A) 加尾信号.41 第三节 基因克隆的基本过程 基因克隆主要分为以下几个步骤：制备目的基因和相关载体；将目的基因和有关载体进行连接；将重组的DNA导入受体细胞；DNA重组体的筛选和鉴定；DNA重组体的扩增、表达和其他研究。 42一、 目的基因的获得（

9、一）从基因组文库中获得 一个生物体的基因组用限制性内切酶部分酶切后 ,将酶切片段克隆在载体分子中 ,所有这些插入了基因组片段的载体分子的集合体 ,将包含了这个生物体的整个基因组 ,也就是构成了这个生物体的基因文库。 43 （二）从cDNA文库（cDNA library）中获得 cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆.（三）用聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增有关DNA片段（四）人工合成44二.载体的选择45三、DNA分子的体外连接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接46（一）黏性末端4748定向克隆49（二）人工接头50（三）加入同聚体尾51（

10、四）平端连接52四、外源DNA导入宿主细胞 将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有以下几种。 （一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection） 53（一）转化（transformation） 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌，并处于感受态，称为感受态细胞（competent cell）。 54（二）感染（infection） 噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染

11、适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导 的 遗 传 信 息 转 移 过 程 也 称 为 转 导 （transduction）。55（三）转染（transfection） 转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 56五、目的基因的筛选和鉴定 将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。57（一） 遗传学方法 1. 抗生素筛选法(1) 单抗生素筛选 大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（ampicillin, Amp）、四环素(tetracyclin

12、e,Tet)、卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。用该法可筛选出转化子，但不能区分含目的基因的转化子和不含目的基因的转化子。58（2）双抗生素筛选5960 含有两个或两个以上选择标志的载体,如pBR322带有Amp和Tet抗性基因，将外源基因插入Tet基因内，则Tet基因失活，所构建的重组质粒转化菌落能在含Amp的培养板中生长，而不能在含Tet的培养板中生长。 612. 蓝-白筛选（互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个

13、氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互补。6263（二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 64 65（三） 核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。66菌落原位杂交的原理 67（四） PCR技术 PCR技术具有高度的

14、灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。 68(五) 酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。（1） 插入片段大小的鉴定（2） 插入片段方向性的鉴定69目的基因正向插入和反向插入的示意图 7071 第四节 真核细胞转染一、真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation） 使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。 7

15、2（二）电穿孔法（electroporation） 将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。73（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。74（四）脂质体介导的基因导入 DNA75（五）显微注射法（microinjection）76二、 转染细胞的筛选 ( 一) TK-细胞突变株筛选转染细胞细胞内TTP的合成有两条途径 从头合成 可被氨

16、基喋呤阻断 补救合成 胸苷激酶(TK)是关键酶TK+: 细胞生长TK- 细胞导入含TK基因的载体: 细胞在HAT培养基生长77（二）药物筛选转染细胞 新霉素抗性基因（neor）编码氨基糖苷磷酸转移酶，使氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）失活。G-418阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。 78 （一）寡核苷酸介导的定点诱变法 第五节 基因的改造 诱变引物通用引物Klenow片段，dNTPT4 DNA连接酶转化大肠杆菌标记诱变引物 原位分子杂交 放射自显影79（二）含U模板法 80（三）PCR介导的定点诱变法81 第六节 克隆基因的表达 一、大肠杆菌表达系统 （一）基因表达

17、的基本要素 1目的基因 目的基因如果来自真核细胞必须是 cDNA 。 cDNA的始密码子（ATG）上游 部分（5端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。82 2载体的选择 所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。 83 3目的基因与载体的连接 （1）起始密码子 （2）融合蛋白 融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。 8485864受体菌株和诱导条件 根据载体启动子选择菌株 确定诱导表达条件 87（二）提高外源基因表达水平的措施 1提高翻译水平 （1）调整SD序列与ATG之间的距离 （2）用点突变的方法改变某些碱基 （3）增加mRNA的稳定性 882使细菌的生长与外源基因的表达分开 将宿主菌的生长和外源基因的表达分成两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷最为常用的一个方法。一般采用温度诱导或药物诱导。