影响禽流感病毒致病性和传播的关键氨基酸位点的研究进展.docx

1、第36卷第2期2014年2月中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.36,No.2Feb.2014doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2014.02.19影响禽流感病毒致病性和传播的关键氨基酸位点的研究进展徐晓龙，包红梅，陈化兰，王秀荣*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001)中图分类号：S852.65文献标识码：B文章编号：10080589(2014)02.016504A型流感病毒根据其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不

2、同分为不同亚型，目前已鉴定出有17种HA亚型和10种NA亚型。禽流感(AvianInfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的急性或慢性呼吸道传染病，根据临床症状不同划分为高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)和低致病性禽流感(Lowpathogenicavianinfluenza,LPAI)OHPAI以急性死亡、高致死率和传染性强为特征，被OIE列为需要实时通报的传染病。禽流感病毒(AIV)为分节段的负链RNA病毒，由8个基因节段组成，其基因组编码1112种蛋白质，包括结构蛋白：HA、NA、基质蛋白(Ml)、离子通道蛋白(M2)、聚合酶复合

3、体(PB1、PB2和PA),核蛋白(NP),核输出蛋白(NEP,即NS2);非结构蛋白：NS1、PB1-F2o哈尔滨兽医研究所首次在国内分离到H5N1亚型HPAI病毒(HPAIV)后，香港发生H5N1亚型HPAIV感染并导致人死亡的事件，为全球首例AIV突破种间屏障直接感染人的现象。一般认为，AIV感染人类是由不同亚型AIV经猪体混合而得以重组，获得结合人类呼吸道细胞的能力。研究表明，该次流行病毒株似乎未经过重组，而是部分氨基酸位点的突变导致病毒跨种间传播及致病性增强。本文就影响AIV致病性及传播的关键氨基酸位点进行如下综述。1HA与AIV致病性和传播的关系HA是AIV囊膜纤突的主要成分，其主

4、要功能是结合宿主唾液酸类细胞受体，辅助病毒吸附宿主细胞，完成内Correspondingauthor吞和脱壳。HA的影响主要体现在以下两个方面。1.1 HA裂解位点处氨基酸序列对致病性的影响AIV借助HA吸附于细胞膜，引起感染，其多个碱性氨基酸裂解位点对AIV致病性起着决定性作用。病毒囊膜与细胞膜融合时HA蛋白裂解为HA1和HA2,HA的裂解位点不同影响了流感病毒的组织嗜性。HPAIV的HA裂解位点处存在连续4个以上碱性氨基酸(-RRRR-),可以被多种蛋白酶所裂解，使其感染宿主并在不同组织细胞中增殖，进而导致宿主的全身感染甚至死亡，而LPAIV在HA裂解位点中一般只有单个碱性氨基酸(R)，这

5、种结构的HA蛋白只能被存在于呼吸道和消化道内的精氨酸特异蛋白酶识别并裂解，因而病毒增殖只发生在呼吸道和消化道等局部，从而导致温和性感染。1.2 HA蛋白中氨基酸位点对致病性的影响香港流感患者体中分离到的AIV,HA蛋白226位点突变为M后，HA蛋白对唾液酸a2,3.半乳糖及唾液酸a-2,6.半乳糖均具有结合能力，这也是AIV可以直接感染人的原因之一。进一步研究表明AIV的HA蛋白第226位氨基酸起关键作用，HA蛋白226位常为Q,228位常为G,而人流感病毒226位为L,228位为S,如226位为Q和228位为G,则易与唾液酸a2,3.半乳糖结合，若226位为L和228位为S则易与唾液酸a.2

6、,6.半乳糖结合。该发现有助于进一步研究AIV突破种间屏障直接感染人的机制。收稿日期：2012-11-28基金项目：十二五农村领域国家科技课题(2012AA101303)；社会公益研究专项计划(200903055)作者简介：徐晓龙(1989-),男，山东青岛人，硕士研究生，主要从事禽流感分子诊断方向研究.*通信作者：E-mail:wxr1-3HA蛋白中氨基酸位点对传播的影响HA能够识别a-2,3半乳糖连接的唾液酸(SAa-2,3.Gal)和a-2,6半乳糖连接的唾液酸(SAa-2,6-Gal)两种类型受体。人的上呼吸道上皮细胞表面主要含有SA.2,6.Gal,而在禽类呼吸道细胞及马的气管和鸭的

7、肠道主要含有SA-2,3-Gal,人流感病毒与SAa-2,6-Gal受体结合，AIV则易与SAa2,3.Gal受体结合，这一生物学特性形成了人-禽流感之间的种间屏障。通过病毒A/DK/GX/35/H5N1对豚鼠水平传播能力的影响研究显示，当HA发生A】叮点突变时，病毒由同时识别SAa-2,3-Gal和SAa-2,6-Gal受体转变为只能识别SAa-2,3.Gal受体，受体结合特性的变化导致该病毒不能在豚鼠间水平传播。目前HPAIV还不能在人类之间传播，Imai等利用H5HA/H1N1重组病毒，发现N158D、Q22%、NK和T318I4个位点的同时突变使得病毒具有在雪貂之间传播的能力，还有研究

8、表明在雪貂间可以通过空气传播的H5N1病毒其H,03Y.T,56A.Q222!.和GS4个位点发生了突变。最新发现为控制AIV在人类之间大肆传播具有重要意义（表Do2NA蛋白中氨基酸位点对致病性和传播的影响NA是AIV囊膜上除HA之外的另一种重要糖蛋白，在病毒吸附宿主细胞时，能够识别细胞受体末端的唾液酸残基并介导病毒进入细胞。Hulse等利用反向遗传技术以A/CK/HK/YU562/01/H5N1的NA基因替换A/GD/HK/437-10/99ZH5N1的NA基因，显示重组病毒对鸡的致病性明显增强，表明NA蛋白对病毒的致病性具有较大影响。NA的颈部是连接头部的酶活性中心和跨膜结构域以及细胞质结

9、构域的一段结构。研究表明，NA颈部的长度与病毒跨种传播和致病力相关。近年研究表明H5N1病毒中NA颈部4869位缺失的分离率呈现逐年增长趋势，而且短颈NA的H5N1病毒更易于表现高致病性。因此，推测这种缺失模式的短颈NA可能是水禽AIV传播到陆生家禽，并对其逐渐产生适应性的一个重要分子标记。3聚合酶复合体与AIV致病性和传播的关系AIV聚合酶复合体由PB1、PB2和PA组成，3种蛋白以非共价键紧密结合形成异源三聚复合体，共同行使病毒RNA的转录和复制功能。3.1PB1蛋白中氨基酸位点对致病性的影响PB1蛋白具有聚合酶活性，其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长。此外，PB1蛋白上的某些氨

10、基酸位点能够影响AIV的致病性。在A/AH/2/05/H5N1和A/CK/SC/81/05/H5N1两株模式病毒株背景下，Zhong等发现PB1蛋白、6知和v祁I的突变，在很大程度上增强病毒对模型小鼠的致病性，同时反方向的突变也能够极大地减弱病毒的致病性，两个位点同时突变作用则更加明显。2001年研究表明，在大部分甲型流感病毒中从PB1基因的+1阅读框（ORF）开始翻译产生新的病毒蛋白（PB1.F2）,该蛋白定位在线粒体，并通过两个线粒体蛋白的相互作用诱导细胞凋亡。研究表明，H5N1亚型病毒PB1-F2蛋白的66位S与N相比，S对鼠的致病性更强。当PB1-F2蛋白发生S%D突变时，病毒的致病性

11、减弱，表明PB1-F2蛋白也是影响AIV致病性的重要因子的。还有研究表明，PB1-F2蛋白与PB1蛋白相互作用，能够影响蛋白在细胞核和细胞质的分布，这也可能影响AIV的毒力吧PB2蛋白中氨基酸位点对致病性的影响PB2亚基能够识别细胞mRNA的5,端的帽子结构，并具有37,的核酸内切活性。研究显示PB2基因能够影响流感病毒的宿主范围。Subbarao等将分离到的1株AIV的PB2基因和人流感病毒的另外7个基因进行重组获得1株重组病毒，对其进行生物学特性分析发现，禽源的PB2基因改变了人流感病毒的宿主范围，进一步研究显示，PB2的627位氨基酸在A型流感病毒宿主范围中起决定作用。Hatta等应用反

12、向遗传学技术对A/HK/483/97/H5Nl（对小鼠致病）和A/KH/486/97/H5Nl（对小鼠不致病）病毒研究，表明PB2蛋白是导致这两株H5N1亚型AIV对小鼠产生致病性差异的关键因素，进一步通过定点突变表明PB2蛋白的E62%突变增强了A/HK/486/97/H5N1对小鼠致病性向。另有研究显示PB2蛋白701位点的N对于AIV跨越物种屏障感染小鼠并在小鼠体内进行复制起到重要作用网。Gao等证明PB2蛋白701位点的N是AIV在豚鼠体内复制所必需的叫PB2蛋白上其他氨基酸位点同样对致病性具有影响，有报道PB2蛋白矽突变能够增强病毒RNA聚合酶在人体细胞中的活性，而且PB2的突变能够

13、显著增强AIV在小鼠组织中的复制能力网。除了单一蛋白上关键氨基酸位点的影响，不同蛋白间以及同一蛋白不同氨基酸位点的联合突变对致病性的影响也受到广泛关注。研究发现H1N1/2009病毒株PB2蛋白中A271T的突变可使AIV在豚鼠中通过飞沫传播的能力丧失，若该突变与HA蛋白QVR突变一起作用则可使AIV在雪貂中飞沫传播的能力丧失该研究为人类进一步研究AIV致病分子机制提供了新的思路和实验依据。3.2 PA蛋白中氨基酸位点对致病性的影响PA蛋白是一种跣酸化蛋白，对聚合酶的结构起着重要的作用，PA蛋白的功能尚不清楚，定点突变表明PA蛋白能够影响AIV的转录和复制。Song等将A/Goose/HB65

14、/H5N1和AZDucWHB49/H5Nl两株病毒定点突变，表明PA蛋白224和383位氨基酸是影响病毒对家鸭致病性的关键位点，证明PA蛋白是影响H5N1亚型AIV对家鸭致病性的主要因素，但具体的机理需要进一步的研究确定口气NS蛋白中氨基酸位点对致病性的影响NS1蛋白是AIV一个重要的毒力因子，具有多种功能，它可以干扰mRNA前体的剪切、polyA的形成以及干扰细胞mRNA从细胞核进入细胞质。同时NS1蛋白中关键氨基酸位点的变化能够使AIV对自然免疫产生拮抗作用。有报道NS1蛋白S42P突变会显著增强A/Duck/Guangxi/12/O3/H5N1在小鼠中的致病力，然而在同样的位置以S代替P

15、将减弱A/Duck/Guangxi/27/03/H5N1的毒力，进一步研究表明NS1蛋白中第42位的S不仅是H5N1病毒对抗宿主细胞干扰素诱导的关键，也是NS1蛋白防止双链RNA介导的NF-kB通路和IRF-3通路激活的关键照。NS2蛋白主要功能是转运病毒复制产生的核糖核蛋白体(vRNP)从细胞核到细胞质，同时NS2蛋白含有核输出信号，能够与核穿孔复合体中某些蛋白相互作用，介导M1-RNP复合体穿过核膜。目前NS2蛋白中关键氨基酸点位对病毒致病性的影响还有待研究。4 NP蛋白中氨基酸位点对致病性的影响NP蛋白为核蛋白，是病毒粒子主要的结构蛋白，为AIV中诱导宿主细胞免疫应答的主要成分。NP蛋白

16、在体内和体外均能够与病毒聚合酶复合体中的PB2和PB1相互结合，但并不与PA相结合，同时其能够与Ml蛋白相互作用从而影响病毒粒子的出芽过程。Tada等发现NP蛋白UelwThr的突变能够促进病毒RNA的合成，增强AIV对鸡的致病力咧。推测该突变可能改变NP蛋白构象，影响其与PB1、PB2以及转录因子之间的相互作用。但NP蛋白对病毒致病性的影响具体机制，以及它与病毒其他蛋白的功能关系尚不清楚。5 M蛋白中氨基酸位点对致病性的影响AIV的M基因编码Ml和M2蛋白。Ml为维持病毒形态的基质蛋白，介导病毒粒子出芽和装配过程；M2蛋白装配于囊膜上作为跨膜离子通道蛋白。研究表明，当Ml蛋白的N3)和T2,

17、5A发生突变时，A/duck/Fujian/01/2002/H5N1在小鼠体内表现出高致病性，而A/duck/Guangxi/53/2002/H5Nl则为较低的致病性，由此证明Ml蛋白中相关氨基酸位点的突变是导致两者对小鼠致病性产生差别的关键表1部分影响AIV致病性和传播的关键氨基酸位点蛋白关健位点作用实验动物HANl58D,QL,N22%,T3,8I病毒获得在雪貂之间传播的能力雪貂"Y,T156A,Q22,GS突变使得病毒具有在雪貂间通过空气传播的能力雪貂DN降低H5N1亚型HPAIV对鸡的致病性鸡所E,26DT,60A病毒传播的关键条件豚鼠PB2701N病毒能够传播的关键条件豚鼠

18、N62对AIV跨越种间屏障感染哺乳动物起了决定作用刖小鼠El58G显著增强病毒在小鼠组织中的复制能力小鼠通过诱导提高糖皮质激素水平增强H9N2病毒毒力闫小鼠PB1-F2N*S使得H5N1亚型AIV致病性增强小鼠PB1s%PB1蛋白622和709位点的突变增强病毒致病性小鼠V709!PAT,57A能够影响病毒的复制能力无H5,0APA蛋白510位点His到Ala的突变降低病毒mRNA的转录无NP1%能够促进病毒RNA的合成，提升HPAIV的致病能力向鸡NS1149A149位为丙氨酸的重组病毒拮抗干扰素生成的能力较强鸡MlmH5N1亚型A1V的Ml蛋白第30位天冬氨酸和215位丙氨酸的累小鼠T21

19、5A加效应是对小鼠高致病力所必需四AI不仅对养禽业危害严重，同时还具有重大公共卫生学意义。因此，加强致病机制研究和加强对AIV的监测和评估，是控制AIV疫情的基本措施。大量研究数据表明AIV的致病性是多因素相互作用的结果，并且与病毒本身和宿主特性有关。HA蛋白裂解位点处的连续碱性氨基酸和与唾液酸受体结合的能力能够影响AIV的宿主范围，NS1蛋白主要涉及影响宿主干扰素的调控，提高致病性，PB2蛋白也能够影响宿主的范围以及促进病毒在宿主体内的复制。目前对HA、PB2及NS1这3种蛋白的影响机制研究较为深入，关于其他蛋白对病毒致病性影响机制目前尚未得到明确统一的结果，这方面的研究将受到更多关注，成为

20、影响AIV致病性和传播的关键氨基酸位点研究领域的新突破点。参考文献：1 HarveyR,MartinAC,ZambonM,etal.RestrictionstotheadaptationofinfluenzaavirusH5hemagglutinintothehumanhostJ.JVirol,2004,78(1):502-507.2 GambaryanAS,PiskarevVE,YamskovIA,etal.HumaninfluenzavirusrecognitionofsialyloligosaccharidesJ.FEBSLett,1995,366(1):57-60.3 GaoYu-we

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