影响禽流感血凝-血凝抑制试验的主要因素.docx

1、影响禽流感血凝-血凝抑制试验的主要因素钟蕴珠，肖国雄（梅县动物卫生监督所，广东梅县514700）摘要：禽流感血凝-血我抑制试脸因其具有简便、快速、准确、实用的特点，在县级兽医实验室被广泛应用.但在试验过程中，人为因素的影响很大，常常因为操作不规范等，导致试验结果不准确，甚至失败.关键词：禽流感；血凝；血凝抑制；影响因素中图分类号：S852.4'5文献标识码：A文章编号：1005-8567（2013）06-0050-02禽流感血凝-血凝抑制试验是目前WHO和0IE进行全球流感监测所普遍使用的试验方法，可用于禽流感亚型抗体水平的检测和流感分离株HA亚型鉴定。该试验因其具有简便、快速、准确、

2、实用的特点，在县级兽医实验室被广泛应用于禽流感亚型抗体水平的检测。但在试验过程中，人为因素的影响很大，常常因为操作不规范等，导致试验结果不准确，甚至失败。现就试验过程中常见的几个主要问题总结如下。1试剂问题PBS的PH值试验用的pH7.2、0.01mol/LPBS应按要求配制、调好pH值。pH值偏酸，易使红细胞自凝，偏碱则易使凝集的红细胞洗脱加快，从而影响试验结果的判定。1.1 1%红细胞悬液的制备由于不同个体鸡只红细胞对病毒的敏感性不同而影响血凝抑制（HD效价，所以一般采用3只以上健康公鸡的红细胞混合使用，最好选用非免疫公鸡。如果选用免疫公鸡代替，则需增加洗涤次数和时间。在最后定容时，离心时

3、间要超过15min,以便压实红细胞泥、准确读数。一般红细胞浓度偏低,HI滴度下降；红细胞浓度偏高,HI滴度上升。1.2 4个血凝单位（HAU）抗原的配制4个血凝单位（HAC）抗原需现配现用。工作抗原效价的测定至关重要，抗原效价过高过低都对试验结果有着很大的影响。效价过高，则HI滴度偏低;效价过低，则H1滴度偏高。为保证4个血凝单位抗原的配制准确无误，必须做抗原回归试验：在微量反应板的1-4孔均加入0.025mLPBS；取4HAU混匀的抗原液0.025mL加入到第1孔中，混匀，然后倍比稀释到第4孔，从第4孔中吸取0.025mL弃之：每孔均加入0.025mL1%鸡红细胞悬液。振荡混匀,室温下静置约

4、40min后观察结果一若前2孔完全凝集（第2孔为完全凝集的终点），则视为抗原配置正确（见图1）。图14HAU抗原回归试验2非特异性凝集因子在进行鸭、鹅等水禽的禽流感抗体检测时，若使用鸡而非相应的鸭或鹅的红细胞悬液，则水禽血清中可能存在的，对鸡红细胞有非特异性糅集作用的因子，使试验出现鸡红细胞不流淌或流淌不完全（非特异性凝集的滴度多集中在（1-3）log2,个别甚至达到61og2）,严重干扰了结果的判定（见图2）。因此,最好采用与被检血清同种禽类的红细胞来进行抗体效价的检测。若无同类水禽红细胞，则可用鸡红细胞吸附法对水禽血清进行处理，以除去非特异性凝集素。处理方法为：每图2非特异性凝集现象图2非

5、特异性凝集现象0.5mL的血清中加入0.025mL的鸡红细胞，轻摇后静置至少30min；800r/min离心约25min,收集上清液即为处理后的血清。3微量反应板的清洗反应板不洁净、不光滑，都会直接影响试验的结果。使用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物,然后浸泡在清洁液中(新反应板可直接放入清洁液中浸泡)，24h后取出，用流水冲洗干净后，再在蒸饲水中冲洗1遍，甩干，摆放在恒温箱中，70°C以下烤干备用。4环境温度的控制试验感作温度，从4C到37C,随着温度上升，HA与HI滴度上升，但在37.C时，凝集的红细胞容易洗脱,4.C红细胞易产生自凝。温度过高，试验结果出现快，但凝集解脱也快，

6、使整个反应板凝集现象消失：温度过低，则试验结果出现慢。故试凝环境温度应按规范要求控制在室温2025,Co5其它应注意的问题5.1加样时应细致认真，避免样品、试剂加在孔壁上或溅出板孔:移液器吸头应垂直加入液体，要保持吸头管嘴与凝集板孔间的距离，不能与孔内液面接触，以免产生污染。5.2稀释血清时，速度不能过快，吸头不要离开液面，以免产生气泡，造成移液量不准确，影响试验结果。5.3病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会人为造成误差。因此，抗原和红细胞使用前-定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。红细胞悬液应轻轻慢摇，避免剧烈摇动，以免造成红细胞破裂。试验操作中不仅要严格按照规定的

7、操作方法操作、细致耐心，更要在一些操作技巧和熟练程度上下功夫，同时综合考虑各方面的因素，发现问题及时纠正处理，这样才会获得满意的试验结果。(上接第47页)检测与分析。4讨论猪场可结合猪瘟抗体检测报告，选择适合自己猪场使用的疫苗。超前免疫后应在6070日龄时加强接种1次。猪瘟病毒严重污染地区还应在25-30H龄时再接种1次。定期检查并淘汰带猪痕野毒的母猪，对于猪瘟的防控至关重要。这样的母猪不仅会使胚胎期或出生前仔猪感染猪瘟病毒而致免疫失败，同时又是猪群持续发生非典型性猪瘟的根源，其后患无穷，必须给予高度重视。为了便于管理，可使用白天分娩技术。建议经产母猪在预产期前23天的早上68时，每头母猪肌注氯前列烯醇0.2mg来调控母猪于白天分娩，有利于仔猪的猪瘟超前免疫,减少超前免疫失败的儿率。但要注意母猪的预产期推算-淀要准确。参考文献：1 程铁城.规模化猪场消灭猪瘟的措施LH.北京农学院学报，1993,8(2):