日本乙型脑炎病毒NS1基因及其疫苗的研究进展.docx

1、doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2012.12.007日本乙曜脑炎痛嚣nsiSB设其is苗的mm王凤，汤建元，李春蕉，曾智聃,甘振磊,刘建，郝飞（贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025）摘要：日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒的三种糖基化蛋白PrM、E和NS1是其主要免疫保护性抗原，其中PrM和E蛋白是日本乙型脑炎病毒的结构蛋白，其结构和相关疫苗研究的报道较多。NS1蛋白是日本乙型脑炎病毒的非结构蛋白，其主要参与病毒复制的早期阶段，推测可能参与病毒组装和释放。可诱导补体依赖性溶细胞反应，不能产生中和抗体，能诱发机体在非中和性抗体

2、存在的情况下产生保护性免疫。在接种乙脑病毒的细胞的细胞内、细胞表面及上清液中均含有大量的NS1蛋白。对小鼠接种NS1蛋白或NS1蛋白特异性抗体，均能让小鼠产生对乙脑病毒感染的保护性免疫作用。本文主要就乙型脑炎病毒非结构基因NS1及其免疫疫苗的研究进展进行综述，为其更进一步深入研究JEVNS1基因及其相关疫苗奠定基础。关键伺：日本乙型脑炎病毒;NS1基因；相关疫苗StudyofJapaneseEncephalitisVirusNSIGeneandItsVaccineWangFengrTangDeyuan,LiChunyan,ZengZhiyong,GanZhenlei,LiuJian,HaoFe

3、i(DepartmentofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou,550025)Abstract:JapaneseencephalitisisaseriouszoonosisdiseasecausedbyJapaneseencephalitisvirus.Threeglycosylationprotein(PrM,E,andNSI)ofJapaneseencephalitisvirusarethemainimmuneprotectiveantigen.PrMandEproteinarethestructureproteinofJapan

4、eseencephalitisvirus;Therearemanyreportsabouttheirstructureandvaccineresearch.NSlproteinisthenon-stmchireproteinofJEV,itisinvolvedintheearlystagesofviralreplication,anditmayalsobeinvolvedinvirusassemblyandrelease.NSIproteindoesn'thaveneutralizationantigenicepitope;Ttcaninducecomplement-dependent

5、cytolyticreactionandinducebodyproduceprotectiveimmuneinthepresenceofnon-neutralizingantibodiesconditions.LargeamountsofNSIproteinexistedinJEVcellculturesupernatant,cellsurfaceandintracellular.MicecanproduceaprotectiveimmuneeffectforJapaneseencephalitisvirusbyinoculatedNSIproteinorpassiveinputNSIprot

6、ein-specificantibodies.ThispapermainlyfocusontheresearchprogressofJEVNSIgeneanditsvaccines,solaythefoundationforfurtherstudyofJEVNSIgeneanditsvaccine.Keywords:JEV;NS1gene;correlationvaccine日本乙型脑炎（Japaneseencephalitis,JE）简称乙脑，是由乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV,乙脑病毒）经蚊虫传播引起的严重的人畜共患传染病。该病主要侵犯患病动物或人

7、的丘脑、脊髓、角细胞、大脑皮质和小脑，引起严重的中枢神经系统损伤。动物感染JEV后的有30%的会死亡，存活下来的50%的动物会留下神经系统后遗症叫WHO（组织）已将JE列为重点防控的传染病。JE主要在亚洲流行，在我国除少数省份外全国各地均有JE流行,不仅对人畜的健康造成极大的危害，还对养殖业造成极大地经济损失，被我国卫生部门列为乙类传染病。澳大利亚和关岛地区由于近年来全球气候的变暖，乙型脑炎的流行区域也在不断扩大而出现乙脑病例。目前对于JE尚无特效治疗方法,因此预防JE的发生非常重要，而疫苗又是控制JE发生的最佳手段，尽管我国生产的SA14-14-2弱毒活疫苗在预防人的日本乙型脑炎的发生起到了

8、重要的作用，但活疫苗毕竟是一种活的微生物，有可能出现毒力反强、带毒、排毒、垂直传播、核酸重组等现象，因此，寻求稳定、安全及新型的日本乙型脑炎疫苗，已经成为近年的研究热点。1乙型脑炎病毒NS1基因结构与功能日本乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长约为11Kb,为单股正链RNA,其基因组包含5,端非编码区(5'-NCR)和3,端非编码区(3，-NCR)及一个大小约10.3Kb的单一开放阅读框(ORF),该ORF几乎跨越整个基因组，无亚基因组结构。单一开放阅读框编码3种结构蛋白：衣壳蛋白(C)、前膜/膜蛋白(PrM/M)和外膜糖蛋白(E),以及7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、

9、NS4A、NS4B、NS5),各基因顺序为：5'-C-PrM/M-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3，。其中NS1是一个含高甘露糖分泌型糖蛋白，分子量约为40kDa,由于在130位和207位存在N-连接糖链，因此在感染细胞内其实际分子量为46kDa左右。在感染细胞的高尔基体和内质网内，E蛋白和NS1蛋白形成一种稳定的复合物，其半衰期长，共同滞留一段时间后，附着于感染细胞表面，且不被分泌到细胞外去，该复合物并不是前体蛋白的不完全水解而是在病毒复制周期中产生的一种非特异性异聚蛋白，没有生物学功能。Mason等用E.coli来表达乙型脑炎病毒抗原，实验表明

10、在乙型脑炎病毒感染的细胞中，NS1蛋白以NS1，和NS1两种形式存在,NS1和NSV在N末端具基金项目：2006年贵州省高层次人才科研条件特助经费项目资助(编号:TZJF-2006年01号)。贵州2011年农业攻关项目资助号:酷科合NY字(2011)3013号。作者简介：王凤(1985-)，女，硕士研完生在读，主要从事动物传染病病原分子生物学专业°通讯作者：汤德元(1964-),男，教授，博士，士生导师，主要从事动物传染病和中西善医结合教学科研工作。有相同的序列,NS1，在C末端还存在一段由基因组的NS2a基因编码的高度疏水的氨基酸序列,NSP的形成机制目前还不清楚。NS1和NS1，

11、的二聚体存在于JEV感染的细胞液和单层细胞中，该二聚体不耐热耐SDSoHomodimer认为NS1以二聚体形式出现是乙脑病毒感染的一个特点。Hamand同等用重组杆状病毒表达NS1,发现细胞外的NS1二聚体自由存在或与膜相互作用形成复合物。NS1是乙型脑炎病毒主要的抗原成分之一，其具体功能目前还不够清楚,推测其与膜功能相关，可能参与乙型脑炎病毒复制、组装和释放囹。它不组成毒粒，具有补体结合活性，但没有血凝抑制活性和中和活性，在没有中和抗体的条件下,NS1可诱生依赖于抗体的Fc片段的保护力。有研究显示NS1表达质粒可激发CTL反应，再者NS1基因和及其表型具有高度同源性，因此NS1基因可作为RT

12、-PCR检测和亚单位疫苗研究的材料。因为NS1可使宿主产生保护性免疫而没有抗体依赖性增强(ADE)作用，因此NS1作为亚单位疫苗比灭活疫苗更有优势叫2乙型脑炎病毒NS1蛋白相关疫苗的研究2.1乙型脑炎梅毒NS1基因亚单位疫苗亚单位疫苗指用表达的蛋白制成的疫苗，其优点是不含核酸物质,安全。E蛋白和NS1蛋白是乙脑病毒的主要免疫原性蛋白，因此,E基因和NSI基因是乙脑亚单位疫苗的候选基因。徐宏山等6L采用RT-PCR法扩增JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白基因片段，分别克隆入原核表达载体pET-30a(+)和pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-30NSl和pET-32E,转化大肠杆

13、菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达水平。两种蛋白经亲和层析纯化后.Westernblot鉴定其反应原性。通过小鼠主动和被动保护力试验及豚鼠病毒血症试验，检测两种蛋白的免疫原性。结果酶切及测序证明重组表达质粒构建正确;表达的重组NS1和E蛋白的相对分子质量分别约为40000和47000,均以包涵体形式表达；纯化的重组NS1和E蛋白的浓度分别为160.7|i”mL和380pg/mL,均具有良好的反应原性;小鼠主动和被动保护力试验表明两种蛋白均有保护活性;豚鼠病毒血症试验显示，NS1蛋白免疫豚鼠后能明显抑制病毒血症的产生。李波等啊根据GenBank中

14、提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段，测序后连接pET282a(+)载体，构建重组表达载体pET-NSl,转化大肠杆菌BL21(DE3)后，利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段，与预期大小一致，测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体PET282a(+)并获得高效表达，表达产物分子量约为45kD,Westernblot分析表明该表达产物具有良好抗原性,该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。此外他还利用

15、生物信息学的方法对该蛋白进行结构预测和功能分析，信号肽序列预测结果表明该蛋白含有一个信号肽序列,为分泌性蛋白，有多个蛋向激酶磷酸化位点，在细胞信号转导过程中与磷酸化与去磷酸化有关，其二级结构含有丰富的环形、螺旋和折叠区。NS1蛋白是在细胞表面合成的一次跨膜糖蛋白，由信号肽序列引导，分泌至细胞外.执行相关生物学功能，含有两个跨膜区和一个胞内区其大部分氨基酸序列及活性中心位于胞外区。乙型脑炎病毒NS1蛋白因可诱生中和抗体而使其在诊断试剂的研发和疫苗研究中具有潜在应用价值。研究表明,JEV的多种表达蛋向及其特定的多肽片段对于乙脑疫苗的研发具有很大的潜力。2.2乙型脑炎病毒NS1基因重组活栽体疫苗重组

16、活载体疫苗是以弱病毒为载体，插入多个或一个靶病毒的抗原基因重组而成的疫苗。MeCown等罔将JEVNS1基因插入杆状病毒表达载体构成重组杆状病毒，将其表达的特异性重组蛋白免疫C57/B小鼠，经强毒攻击后有70%的小鼠获得保护，而非免疫的C57/B小鼠经强毒攻击后仅有30%的小鼠获得保护，由此可见,重组蛋白可刺激小鼠产生保护性抗体。徐高原仞等将JEVNS1基因插入到中间转移载体pUSK中构建重组pUSK-NSl中间转移表达质粒。将pUSK-NSl与伪狂犬病毒Ea株TK2/gG2/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，经空斑纯化后获得JEVNS1基因重组伪狂犬病毒株TK2/gG2/NSl+o研究

17、结构表明，重组伪狂犬病毒能表达JEVNS1蛋白。该重组伪狂犬病毒可作为伪狂犬病和JEV的双价基因工程疫苗毒株。彭丽英，汪明应用RT-PCR方法扩增出日本乙型脑炎病毒(JEV)的NS1基因，通过SalI/EcoRI双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中。重组穿梭质粒经过双酶切和PCR鉴定后进行测序.序列测定正确。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEVNS1蛋白。这一结果为基因工®疫苗的研制及JEV抗体的检测奠定了基础。Konishi等【明研制了能表达乙型脑炎

18、病毒NS1非结构蛋白的重组NYVAC疫苗，接种猪后产生血凝抑制抗体(HI)和中和抗体，加强免疫后，可抵抗JEV强毒攻击，不产生病毒血症©Kanesa-thasan等时比较了NYVAC-JEV和ALVAC-JEV活载体疫苗，结果显示NYVAC-JEV和ALVAC-JEV均可诱导人体产生中和抗体，但由于体内已有的痘苗病毒抗体可抑制重组活载体疫苗的抗体应答，导致AL-VAC-JEV抗体应答较差。目前为止人类还不了解病毒的自然发生及变异机理,也就无法控制重组病毒的未来走向，一旦将重组病毒投入自然界中，其生物学特征有可能改变，演变出对人畜有害的晚前毒。另外,由于以病毒为基础的载体存在抗体免疫应

19、答问题，所以乙脑病毒的抗原基因插入痘病毒载体所得到的重组活载体疫苗不能保护已免疫或感染活载体相应病毒的动物。因此目前重组活载体疫苗的实用价值和安全性倍受争议。2.3乙型脑炎羯毒NS1基因核酸疫苗核酸疫苗又称DNA疫苗,是将编码病毒抗原基因插入真核表达载体上，构建真核表达质粒，将其导入动物机体，在动物细胞内通过其转录系统合成抗原蛋白，诱导动物产生对该病毒抗原的免疫保护。目前与乙型脑炎病毒核酸疫苗研究有关的乙型脑炎病毒基因主要集中于PrM基因、E基因以及NSI基因等。Lin等1131用乙型脑炎病毒PrM/E.NSl基因的cDNA经皮下接种于小鼠体内，实验发现，用PrM/EcDNA免疫小鼠经强毒攻击

20、后70%的小鼠获得保护，而用NS1cDNA免疫的小鼠经强毒攻击后90%的小鼠获得保护。对照组,用pcDNA免疫的小鼠经强毒攻击后也有40%的小鼠获得保护，由此可知真核表达载体有非特异性免疫佐剂作用。在NS1cD-NA免疫的小鼠体内没有检测到中和抗体，但在补体参与条件下,NS1cDNA对乙型脑炎感染的细胞有很强的溶细胞作用。有研究表明,NS1可在细胞表面表达并分泌大量的同型二聚体,NS1，却不能，且NS2A会下调NS1基因疫苗的效果，因此，用NST的cDNA免疫小鼠经强毒的攻击后没有保护作用。无论对小鼠免疫抗NS1单克隆抗体，还是NS1非结构蛋白,都能证明乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1足够引发保护

21、性免疫并具有激发保护性免疫的表位。早期许多学者以痘苗病毒、Sindbis病毒和杆状病毒等重组病毒为活载体的研究结果表明，乙型脑炎病毒的非结构蛋白NS1对宿主产生保护作用的水平并不高。导致这种差异原因可能是由于使用不同毒株的NS1序列或不同的表达系统。也可能是非结构蛋白NS1在病毒载体的存在下只能作为很弱的免疫原；另外,在NS2A的一些多余序列存在的情况下，NS1也不能产生有效的免疫保护，这些实验结果与过去对登革热的研究结果相吻合，即在登革热病毒NS1加上15%的NS2A序列条件下，重组痘苗病毒含登革热病毒NS1经不住登革热病毒的攻击时。使用核酸疫苗进行免疫能消除在活疫苗制备中存在的抗原所致的免

22、疫应答，且不用顾虑感染因子所带来的诸多问题，还能够诱导广泛的细胞及体液免疫应答，产生高水平保护14免城体。但核翰斐苗效力的好坏也取决于许多因素，如抗原自身的特性、免疫途径、是否使用佐剂或使用佐剂的类型等,所以现在人们对影响核酸疫苗效力的各种因素展开了研究。如果核酸疫苗潜在的安全性和接种方法能够得到解决和改进,将具有很大的开发潜力和应用前景。同时JEV核麽螂的开发和利用也将会有广阔的前景。目前评价日本乙脑疫苗的免疫抗体效价均依据产生中和抗体水平,这对弱毒疫苗是不够全面的,因此要准确检测不同活疫苗的免疫效价，还需要建立抗NS1非结构蛋白抗体和其他细胞免疫的检测技术。由于日本乙脑灭活疫苗在体内不复制

23、,不产生NS1，免疫后缺乏NS1抗原诱导的免疫应答，导致其免疫原性较活疫苗差。NS1疫苗的优点在于它不产生抗体依赖性增强作用,是理想的候选亚单位疫苗。黄病毒NS1基因及其表型具有高度同源性，其核酸序列可用于包括JEV在内的7种黄病毒，因此NS1疫苗有可能成为一种通用的黄病毒亚单位疫苗。相信不断出现的重组JEVNS1蛋白，将很可能作为亚单位疫苗在不同动物模型中进行免疫效力评价。BGY参考文献：1SolomonT.DungNM.KneenR,etal.JapaneseencephalitisJJ.NeuroNeurosurgPsychiatry,2000.68:405-415.2JMasonPW.

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25、yj992.191(2)：826-836.4 LiuX.CaoSZhouRvetd.Inhibitionofjapan破encephalitisvirusNS1proteinexpressionincellbysmallinterferingRNAsJ.VinisGenes,2006,33：69-75.5 HaisteadSB.Pathogenesisofdengue：challengesofmolecularbiologyJJScience,1988,239:476-48.6 徐宏山.俞永新.贾丽丽.乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1和E蛋白的原核表达及其免疫原性.中国生物制品学杂志，2

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