比色法与核磁共振法测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量的比较.docx

1、.论著比色法与核磁共振法测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量的比较袁菲，李阿妮，罗树权,孔素娟，马钵，王晶，李燕婷，刘方蕾兰州生物制品研究所有限责任公司第-研究室甘肃省疫防工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的比较Hestrin比色法(简祢比色法)和核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)法在检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基(O-Acetyl,OAc)含量的相关性和精密度。方法用比色法和NMR法测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌英膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群英膜多糖水解物的OAc含fit,比较分析两种方法的

2、相关性及精密度。结果两种方法检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含量的决定系数分别为尸N0.954&N0.960、正N0.969、中no.972；比色法检测3批C群脑膜炎球菌荚膜多糖(PSC)OAc含蛾的精密度，SO值分别为0.21,0.21,0.18,对应CV值分别为9.03%,9.01%、8.70%(95%置信区间);NMR法检测3批A群脑膜炎球菌荚膜多糖(PSA)OAc含量的精密度,SD值分别为0.66.0.78、0.83,对应CV值分别为0.72%、0.85%、0.93%(95%置信区间)；结论比色法和NMR法在检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含

3、量方面相关性良好，精密度良好.核磁法较比色法精密度更高°关键词：A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟曲;氧乙酰基含虽;核磁共振法；比色法中图分类号：R378文献标志码：A文章编号：1005-5673(2017)06-0013-09DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.003ComparisonofHestrincolorimetricandNMRmethodsinanalysisofO-acetylcontentofgroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalcapsularpolysaccharidesYUANFei,UA-ni,L

4、UOShu-quan,KONGSu-juan,MAYu,WANGJing,UYan-ting,LIUFang-leiFirstDepartmentofResearch,IxinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,lid.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:LIUFang-lei,E-mail:lflei30Abstract:ObjectiveTocomparetheHestrincol

5、orimetricandNMR(nuclearmagneticresonance,NMR)methodsinanalysisoftheO-acetyl(OAc)contentfbrthegroupsA,C,YandW135Neisseriameningococcalcapsularpolysaccharides(PSC).MethodsTousetheHestrincolorimetricandNMRmethodsinanalyzingtheOAccontentofthegroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalPSCandtheir*sderivativ

6、esandOAccontentfromhydrolyzedPSCingroupsYandW135.Theconsistencyandprecisionwerecomparedbetweenthetwomethods.ResultsThecorrelationcoefficientR*N0.954,0.960,0.972,0.969wereobnUiinetlbyusingbothmethods.TheinternalSDwere0.21,0.21,0.18andCVwerc9.03%,9.01%,8.75%(95%Cl).respectively,indeterminationOAcconte

7、ntfrom3lotsPSCbyHestrincolorimetricmethod；andtheinternalSDwere0.66,0.78and0.83,andtheCVwere0.72%,0.85%and0.93%byNMRincorrespondence.ConclusionThegoodcorrelationandprecisionwereobtainedinanalyzinggroupsA,C,YandW135NeisseriameningococcalPSCbyusingofHestrincolorimetricandNMRmethods,andthelaterhadanbett

8、erprecision.Keywords：GroupsA,C,Y,W135Neisseriameningitides；O-Acetylcontent；Nuclearmagneticresonance(NMR)；Hestrincolorimetricmethod基金项目：国家科技重大新药创制专项(20I3ZX09402-302-215)作者简介：袁菲(1982-),女，医学生物学工程师，主要从事细菌性多糖蛋白结合疫苗的研发工作。通信作者：刘方蕾，研究员,E-mail：lflei30脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)(以下简称脑膜炎球菌)是脑膜炎(meningitis)和脑

9、膜炎球菌血症(meningococcemia)等侵袭性细菌感染的主要致病菌。荚膜多糖是脑膜炎球菌一种重要的毒力因子，其生物组分不同，可分为13个血清型，A、B、C、W135、X和Y是主要的致病血清型。其中，A群脑膜炎球菌荚膜多糖的C-3位和C-4位;C群荚膜多糖的C-7位和C-8位;Y群荚膜多糖的C-7位和C-9位以及W135群荚膜多糖的C-7位和C-9位均存在氧乙酰化修饰，见表1。氧乙酰基（O-Acetyl,OAc）是脑膜炎球菌荚膜多糖上的重要功能基团，但其化学性质不稳定，在结合物的制备过程中容易丢失。A群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc去除后导致多糖的免疫原性降低。OAc含量是脑膜炎球菌多搪疫苗和

10、多糖蛋白结合疫苗生产过程中十分重要的质控指标,WHO和欧洲药典均对其提出了明确的质控要求质6】。表1脑膜炎球菌英膜多糖重复单位结构Tab.1StructureoftherepeatunitsofCPSsfromthefourgroupsofmeningococcalpolysaccharidesfourmeningococcal荚膜多糖血清型结构A*6)-a-D-ManpNAc-(1-PO4-*13,4OAcC-2-a-I)-NeupNAc-9-»|7,8OAcY-6)-a-Glcp-(1-*4)-a-NeupNAc-(2|7,9OAcW135-*6)-a-(>alp-(l-*

11、4)-a-NeupNAc-(2-#|7,9OAcllestrin比色法（简称比色法）和核磁共振（rmbearmagneticresonance,NMR）法是目前运用最广泛的两种测定OAc含量的方法。中华人民共和国药典2015版（三部）（简称中国药典）推荐使用比色法，欧洲药典等也仍沿用传统的比色法计算OAc含量。近年来，NMR法的发展在鉴别细菌多糖结构和纯度、指导细菌多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗的质量提升方面做出了极大的贡献,WHO相关指导原则要求各监管机构尽可能采用NMK法进行多糖质虽的分析质控。重要的是，比色法只能计算OAc总含员，而NMR法却能区分不同位置上的氧乙酰化修饰情况。本研究采用比色

12、法和NMR法测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌英膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群荚膜多糖水解物的OAc含量，进行相关性分析，并对两种方法的精密度等进行了比较,现将结果报告如下。1材料与方法1.1样品A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖由兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗一室提供；A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物，Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖水解物均由兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室提供。具体批号见表2。1.2主要试剂及仪器氯化乙酰胆碱、盐酸羟胺、盐酸、酷酸钠、三氯化铁、氢氧化钠，均购自国药集团化学试剂有限公司。UV.2550紫外分光光度计购自日本岛津公司；B

13、ruker600MHz核磁共振谱仪购自瑞士Bruker（布鲁克）有限公司；ScientificVORTEXGENIE振荡器购自美国SI公司。1.3溶液的配制2mol/L盐酸羟胺溶液：称取盐酸羟胺13.9g,加水溶解并稀释至100mL,28Y保存;3.5mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠14.0g,加水使溶解并稀释至100mL；4mol/L盐酸溶液:量取盐酸33.3mL,加水稀释至100mL；0.37mol/L三氯化铁-盐酸溶液：称取三氯化铁（FeCl3-6H,0）10.0g,加0.1mol/L盐酸溶液溶解稀释至100mL；碱性羟胺溶液：量取等体积的盐酸羟胺溶液（2mol/L）和氢氧化钠溶液（

14、3.5mol/L）混合,3h内使用。1.4 供试品的制备14.1对照品溶液的制备称取已干燥至恒亚的氯化乙酰胆碱22.7mg,置50mL容量瓶中，加0.001mol/L醋酸钠溶液（pH4.5）溶解并稀释至50mL,摇匀。1.4.2样品溶液的制备取各样品,用水稀释成OAc浓度为0.52.5mmol/L的溶液，OAc含量的检测1.5.1NMR法参照文献7J检测供试品OAc含量，检测温度为298K（25T）,选择的脉冲程序为zgo具体参数设置如下:采样点数为64k,图谱宽度为8012Hz,采样时间为4.089s,弛豫延迟时间（叫）为57、扫描次数（NS）N64。信号经傅里叶转换后加入0.3Hz的窗口函

15、数，最后使用Topspin3.0软件处理结果。0】值采用67倍的7；值,PSA的1）,值设定为18,PSC、PSY和PSW的0值为20,NS值设置为128次。1.5.2比色法参照中国药典，进行OAc含鼠的测定。1.6方法验证1.6.1比色法和NMR法相关性用比色法两次检测的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含量结果为X,NMR法两次检测的OAc结果为V,计算各样本的均值（*和Yt）、样本重复测定值间差值的绝对值和D,）及两种方法测定结果均值间的差值（r-x.）。计算样本重复测定值间差值（七,和DQ的平均数和两种方法测定结果均值间差值（K-X）的平均数，超出上述平均数4倍时，为离群值

16、，应予删除。以匕对X,作散点图，以（E-M）对R作偏差图，得到每个结果的散点图和偏差图，同时计算两种方法的线性回归方程。估算各样品的预期偏差、相对偏差和预期偏差95%的置信区间。当估计误差大于预期偏差置信区间的上限或小于预期偏差置信区间下限时，差异较大，偏差不能被接受；当估计误差位于预期偏差置信区间上限与下限之间时，差异相当，偏差可以接受。1.6.2精密度对3批C群荚膜多糖HP20I505002.HP201505003.HP201505004用比色法重复检测OAc7次，对3批A群荚膜多糖PSA试HP201506001、PSA-试HP201604001、PSA-试HP20101101用NMR法重

17、复检测OAc12次,计算检测结果的平均值、标准偏差（SO）及变异系数（CV）02结果2.1比色法和NMR法检测OAc含量结果的相关性分析两种方法检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含量:决定系数分别为R2N0.954、必no.960、足no.969、&2no.972,见表36和图14。两种方法在各型荚膜多糖检测OAc含量时，估计误差位于预期偏差置信区间上下限之间，偏差均可接受，见表7。2.2精密度2.2.1比色法的精密度3批PSCOAc含量的精密度检测,SD值分别为0.21A21.0.18,对应的CV值分别为9.03%、9.01%、8.70%,3批批次CV值均<10

18、.00%，见表8。2.2.2NMR的精密度3批PSAOAc含量的精密度检测,SD值分别为0.66、0.78.0.83,对应的CV值分别为0.72%、0.85%、0.93%,3批批次CV值均<1.00%，见表9。表2A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、衍生物及水解物批号Tab.2Thelotofcapsularpolysacharide,itsderivativesandhydrolysedproductfromGroupA,C,Y,W135Neisseriameningitidis血清型样品批号A群多糖PSA-200807005；PSA-201011001；PSA-20130500

19、3；PSA-201506001；PSA-201604001；PSA-201609002；PSA-201612001多糖衍生物PSA-DAB201603001；PSA-DAB201603002；PSA-DAB201605003；PSA-DAB201605004；PSA-DAB201609014-201609018；PSA-DAB20170300I；PSA-DAB201703002C群多糖PSC-201604001；PSC-2016U001多慵衍生物PSC-DAB201509005,4FF纯化；PSC-DAB201603001；PSC-DAB201603001,4FF纯化；PSC-DAB20160

20、3002-006；PSC-DAB201605007；PSC-DAB201605007.还原后；PSC-DAB201703001W135群多糖PSW-精20100504；PSW-201602001多糖衍生物PSW-DAB201508006；PSW-DAB201603001；PSW-DAB201603001,4FF纯化；PSW-DAB201603002-201603002005；PSW-DAB201604005,4FF纯化；PSW-DAB201604006Y群多糖水解物PSW-hydro201603005-201604008多糖Y-试P201602001多糖衍生物Y-DAB-试HD-2016030

21、01-HD-201603009；Y-DAB-试HD-201603001,4FF纯化；Y-DAB-试HD-201604010；Y-DAB-试HD-201604010,4FF纯化；Y-DAB-试HD-201604010,4FF再纯化多糖水解物Y-hydrolysate试HH201604008；Y-hydrolysate-试HH201604009表3用两种方法分别检测A群荚膜多糖及其衍生物的OAc含量Tab.3ThedetectedcontentofOAcforcapsularpolysaccharidesanditsderivativefrommeningococcalgroupAbycolori

22、metricandNMRmethodsA群多糖批号比色法检测OAc(mmol/g)NMR法检测0Ac(mol/mol)匕匕2YX,XPSA-2008070052.382.3990.1591.070.010.9288.23PSA-2010110012.012.0384.6084.670.020.0782.62PSA-2013050032.622.8693.7594.000.240.2591.14PSA-2015060012.552.8292.7092.970.270.2790.15PSA-2016040012.302.3988.9589.400.090.4586.83PSA-2016090022

23、.162.3486.8586.960.180.1184.66PSA-2016120012.222.3487.7587.870.120.1285.53PSA-DAB2016030012.372.6590.0090.010.280.0187.50PSA-DAB2016030022.612.8693.6093.720.250.1290.93PSA-DAB2016050032.242.4088.0588.520.160.4785.97PSA-DAB2016050042.152.3686.7087.380.210.6884.79PSA-DAB2016090142.382.5690.1590.660.18

24、0.5187.94PSA-DAB20I6090152.242.4788.0588.400.230.3585.87PSA-DAB2016090162.202.2287.4587.550.020.185.29PSA-DAB2016090172.232.3287.9088.340.090.4485.85PSA-DAB2016090182.412.6090.6091.150.190.5588.37PSA-DAB2017030012.482.7891.6592.270.300.6289.33PSA-DAB2017030022.332.4389.4090.390.100.9987.52908812.448

25、x+59.566/r=0.954841.92.12.3比色法测定OAc含罐(mmol/g)图1用两种方法检测A群荚膜多糖相关性Fig.1CorrelationanalysisofcapsularpolysaccharidesfromGroupAbycolorimetricandNMRmethods表4用两种方法分别检测C群荚膜多糖及其衍生物的OAc含量Tab.4ThedetectedcontentofcapsularpolysaccharidesanditsderivativefrommeningococcalgroupCbycolorimetricandNMRmethods比色法检测OAc(

26、mmol/g)NMR法检测OAc(mol/mol)C群多糖批号0、Dfx.x2Y,Y2PSC-2016040012.342.3780.7981.680.030.8978.88PSC-2016110012.572.8984.2484.560.320.3281.67PSC-DAB201509005,4FF纯化2.642.9085.2985.830.260.5482.79PSC-DAB2O16O3OO12.832.9388.1488.980.100.8485.68PSC-DAB201603001,4FF纯化3.083.3991.8991.910.310.0288.67PSC-DAB201603002

27、2.332.5480.6481.220.210.5878.50PSC-DAB2016030032.302.3480.1980.330.040.1477.94PSC-DAB2016040042.362.4181.0982.050.050.9679.19PSC-DAB2016040052.042.2576.2977.070.210.7874.54PSC-DAB2016040062.462.5082.5982.860.040.2780.25PSC-DAB2016050072.302.5980.1980.960.290.7778.13PSC-DAB201605007，还原后2.392.6881.548

28、1.920.290.3879.20PSC-DAB2017030012.292.4080.0480.720.110.6878.049590(一ouvlolussz(一ouvlolussz502.2y=13.408X+4B.7UR?=0.9602.42.62.8比色法测定OAc含ft(mmol/g)3.03.23.4图2用两种方法检测C群荚膜多糖相关性Fig.2CorrelationanalysisofcapsularpolysaccharidesfromGroupCbycolorimetricandNMRmethods表6用两种方法分别检测Y群英膜多糖及其衍生物，水解物的OAc含量Tab.6Th

29、edetectedcontentsforcapsularpolysaccharides,O-acetyl,anditsderivativefrommeningococcalGroupYbycolorimetricandNMRmethodsY群多糖批号比色法检测OAc(mmol/g)NMR法检测0Ac(mol/mol)匕y20,D,YEY-试HP2016020010.790.9031.9032.210.120.3131.21Y-hydrolysate试HH2OI6O4OO80.700.7830.5530.770.090.2229.92Y-hydrolysate-试HH20I6040090.690

30、.8730.4730.590.180.1229.75Y-DAB-试HD-2O16O3OO10.770.8431.6131.740.070.1330.87Y-DAB-试HD-201603001,4FF纯化0.760.9331.5431.930.170.3930.89Y-DAB-试HD-2O16O3OO20.780.8831.8832.310.010.4331.26Y-DAB-试HD-2O16O3OO30.770.8831.6131.730.110.1230.85Y-DAB-试HD-2016030040.600.7429.0629.100.140.0428.41Y-DAB-试HD-20160300

31、50.590.7328.9729.290.140.3228.47Y-DAB-试HD-2016030061.051.0835.8736.J20.030.2534.93Y-DAB-试HD-2016030071.011.1235.2735.430.110.1634.29Y-DAB-试HD-2016030090.910.9933.8034.240.080.4433.07Y-DAB-试HD-2016040100.670.7530.2030.450.080.2529.61Y-DAB-试HD-201604010,4FF纯化0.600.6629.1229.260.060.1428.56Y-DAB-试HD-20

32、1604010,4FF再纯化0.600.6129.1229.370.010.2528.6437y=15.129x+19395/?2=0.97235333129271.01.01.20.40.60.8比色法测定OAc含tt(mmol/g)图4用两种方法检测Y群多糖相关性Fig.4CorrelationofO-acetylcontentincapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupYbycolorimetricandNMRmethods表7A、C、W135、Y群荚膜多糖OAc含量检测结果偏差分析Tab.7VarianceanalysisofO-acetyl

33、contentincapsularpolysaccharidefromthefourmeninicocalgroups英膜多糖血清型预期值预期偏差相对偏差（%）A89.200.670.70C80.200.600.74W13526.500.291.10Y28.500.702.30表8比色法检测3批C群荚膜多糖OAc含量的精密度Tab.8TheprecisionfordetectedO-acetylcontentincapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupCbycolorimetricmethod测定次数3批PSCOAc含量的精密度（mmol/g）PSC

34、试HP201505003PSC试HP201505002PSC试HP20150500411.932.311.7922.252.121.9232.152.062.2742.291.992.1452.232.561.8762.522.462.2672.592.442.00均值2.282.282.04SD0.210.210.18CV(%)9.039.018.70表9NMR法检测3批A群荚膜多糖OAc含量的精密度Tab.9TheprecisionofdetectedO-acetylcontentfromcapsularpolysaccharidefrommeninicocalgroupAbyNMR测定次

35、数3批PSAOAc含量的精密度（mmol/mol）PSA试HP201506001PSA-试HP201604001PSA-试HP20101101192.0292.0186.88291.8291.9289.38390.9491.0189.35491.3990.3788.86590.7592.7287.91691.4990.5489.21792.6790.6688.89892.2091.8188.37992.1492.7988.321092.6990.9689.161192.0191.4188.521293.0091.1386.93均值91.9391.4488.48SD0.660.780.83CV(

36、%)0.720.850.933讨论比色法作为检测细菌荚膜多糖OAc含髭的经典方法，经过广泛的运用，其检测限、线性范围、准确度、精密度、稳定性等均得到广泛的验证，但此方法只能计算OAc总含量，而不能区分不同位置上的氧乙酰化修饰情况。随着疫苗可控性不断提升，需要提供多糖结构的详细信息,NMR检测技术的发展和运用是一种发展趋势，同时WHO已认可NMR检测方法，并推荐其应用于多糖或多糖蛋白结合疫苗的生产和质量控制中。从研究结果来看，在严格控制各种标准试验条件基础上，比色法和NMR法在检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含量方面均有良好的相关性，估计误差位于预期偏差置信区间的上下限之间，偏

37、差均可接受。比色法检测PSCOAc含最的精密度，S。值分别为0.21、0.21.0.18,对应CV值分别为9.03%、9.01%、8.70%；NMR法检测PSAOAc含量的精密度,SZ)值分别为0.66、0.79、0.83,对应CV值分别为0.72%、0.85%.0.93%；表明使用两种方法检测OAc含量的精密度均为良好。NMR检测OAc含量隶属定量核磁共振(quantitativenuclearmagneticresonance,qNMR)中相对含量检测范畴。它的检测条件参数设置非常严格，如D,就是其中最重要的参数之一,qNMR检测时必须5乌才能保证99.3%-99.9%的激发态的原子核回到

38、平衡态，只有这样才能确保积分面积与质子数成正比，从而保证定量的准确性;不同的化合物T.值是不同的，且其值受环境温度、样品浓度、离子强度等因素的影响;另一个重要参数是NS,它和Di值不同，直接对qNMR的精密度产生影响。除以上所列的参数外，还有其他一些重要参数也值得关注，如采样时间、脉冲序列、激发角度、窗口函数选择等，它们也都对定量的准确性和精密度有一定程度的影响。最重要的是，不同实验室对NMR检测结果所采取的计算标准差异较大。因此，迫切需要对NMR法进行方法学的标准化并进行广泛验证，使其检测结果具有可比性。比色法测定OAc的标线范围是0.02.5mmol/g,最准确的样品测定范围仅是1.01.5mmol/g,而NMR定量测定时信噪比达到500:1,信号和噪音可完全区分