犬细小病毒VP2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与检测.docx

1、中图墓孕透握2011,27(7):352-355ChineseAgriculturalScienceBulletin犬细小病毒VP2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与检测毕聪明1,费东亮，陈强二赵刚”('辽宁医学院奋牧售医学院，辽宁锦州121001辽宁省重点疫病应急中心，沈阳110000)摘要：为表达犬细小病毒VP2蛋白(CPVVP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究，根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物，以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板，进行PCR扩增，把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、签定。将克隆的VP2基因

2、片段克隆至原核表达栽体PGEX-6P-1,再将构建成功的原核表达质粒栽体PGEX-6P-VP2转化至大肠杆菌BL21中，进行鉴定、测序、表达。结果表明，克隆的VP2基因片段全长1755bp,与6个VP2基因序列的同源性为98.7%99.7%。Western-blotting分析显示，表达产物约为90kD的融合蛋白，可被犬细小病毒阳性血清所识别，具有良好的反应原性。关键词：犬细小病毒;VP2基因；克隆;表达中图分类号:Q813.1+1文献标志码:A论文编号:2010-2878Clone,ExpressionandDetectionofCDVVP2GeneinE.coliBiCongming1,F

3、eiDongliang1,ChenQiang1,ZhaoGang"AnimalHusbandryandVeterinarycollege,LiaoningMedicalUniversity,JinzhouLiaoning121001;'TheintensiveepidemicsemergencycenterofLiaoningShenyangLiaoning110000)Abstract:ToestablishayeastPichiapastorisexpressionsystemexpressingcanineparvovirusVP2protein(CPVVP2)tose

4、rvethediagnosisofCPV,developmentofCPVvaccineandresearchofVP2proteinfunction.TotestthestructureandfunctionofVP2proteinindiagnosesandimmunizationinCDV.ApairofprimerswasdesignedandsynthesizedbasedonCanineParvovims(CPV)fromGenBank,andtheVP2geneofCPVwasclonedfrombloodystoolofadeaddogbyPCR.Theresultsshowe

5、dthatthecompletesequenceoftheVP2genewas1755bpinlength.Thenucleotidehomologyrespectivelywasin98.7%-99.7%.ThentheVP2genewasexpressedbyexpressionvectorinBL21.TheexpressedproductionsweredetectedbySDS-PAGEandWestern-blotting,andtheresultsshowedthattheVP2proteinwashigh-efficientlyexpressedinE.coli.Keyword

6、s:CPV;VP2gene;clone;expression0引言犬细小病毒(canineparvovirus,CPV)属于细小病毒科细小病毒属猫细小病毒亚群。CPV是引起犬细小病毒病的重要病原，该病临床主要表现为出血性肠炎和心肌炎。1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等从患出血性肠炎的病犬中首次分离到此病原。感染CPV发病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要临床特征，幼犬的易感性高，可引发心肌炎，发病率为50册100%，死亡率为050%叫CPV对养犬业和经济动物养殖危害很大，并且也影响到了野生动物的生存叫日前，临床上分离CPV的预防主要是疫苗接种，但免疫失败和免疫耐受经

7、常发生。主要原因基金项目：辽宁省教育厅高等学校科学研究项目“共表达IL-2和犬细小病毒重组VP2蛋白亚单位疫苗的研究"(L2010263)；辽宁医学院博士科研启动基金资助“小鼠精填干细胞起始分化基因的筛选"(2008DI1).第一作者简介：毕聪明，男，1973年生，黑龙江省海伦市人，副教授，博士学位，主要研究方向为动物生物技术与胚胎工程.通信地址：121001辽宁省锦州市人民街5段48号辽宁医学院俗牧兽医学,TelE-mail:bicongming747.收稿日期：2010-10-09,修回日期：2OIO-12-O5.有母源抗体的干扰、病毒抗原的

8、漂移和强毒株的出现叫因此，利用基因工程技术生产不受母源抗体干扰和提供多种抗原保护的合成肽疫苗、重组活载体疫苗和表位疫苗是未来疫苗发展的新方向阪)。试验中，对临床分离1株CPV-2亚型VP2基因进行克隆测序,在此基础上，利用PGEX原核表达系统对VP2进行了表达，采用Westernblot分析表达产物的反应原性，为进一步研究该毒株的基因功能、筛选具有抗原表位以及开发研制抗犬细小病毒的基因工程疫苗和诊断试剂提供依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与载体大肠杆菌JM109>BL21(DE3)菌株为畜牧兽医学院分子生物实验室保存,PGEX-6p-l表达载体为Pharmacia公司产品，pM

9、D18-T克隆载体为TaKaRa公司产品。1.1.2病料的采集与预处理从辽宁医学院附属兽医院收集疑似CPV感染犬血便，用生理盐水稀释成20%悬液，加入青、链霉素，终浓度为1000IU反复冻融3次,12000r/min离心5min,取上清液，经0.22mm滤膜过滤除菌后为分离病毒样品,4丁保存备用。1.1.3酶与试剂TrizolReagent购自Invitrogen公司；PftiDNAPolymerase购自Promaga公司；蛋白腺、酵母提取物、Ex-tag酶和各种核酸内切酶购自TaKaRa大连公司；质粒DNA快速小提试剂盒、DNA片段回收试剂购自维特洁生物技术公司,T4DNA连接酶。1.1.

10、4标准参照物标准分子量DNAMarkerDL-2000(分子量为2000、1000、750、500、250、100bp),蛋白质分子量标准(宽)为TaKaRa公司产品。1.1.5主要仪器PCR仪Tpersonal2000型、GeneQuant核酸浓度测定仪、电泳仪DY-III型、紫外透射反射分析仪WP型、超净工作台。1.2方法1.2.1病毒DNA的提取应用煮沸法提取病料中的DNA：取300匹上述病毒悬浮液于1.5mL的离心管中，沸水浴5min,冰浴5min,12000r/min离心10min,取适量上清液用灭菌三蒸水做1:10稀释,-20%：保存备用。1.2.2PCR引物的设计根据已经发表的C

11、PV-b(M38245)基因组序列,借助于Primer5.0生物学软件设计了1对引物，由大连宝生生物工程技术服务有限公司合成。VP2上游引物为Pl：5'-gcGAATTCatgagtgatggagcagttc-3'VP2下游引物为P2：5七gcGTCGACttaatataattttctaggtgCc-3*其中黑体为引入的酶切位点EcoRI和Sallo扩增条件为：94T预变性5min；94%：变性45s,55Y退火45s,72T延伸45s,30个循环;最后72勾延伸10min。将回收到的PCR产物与pMD18-T载体连接。构建克隆质粒pMD-VP2。1.2.3VP2基因序列测定将

12、克隆质粒pMD-VP2送到测序公司进行测序。1.2.4原核表达载体的构建及鉴定利用限制性内切酶EcoRI和SalI对克隆质粒pMD-VP2和表达载体质粒pGEX6P进行双酶切，得到目的基因和大片段。通过T4DNA连接酶连接，并挑选阳性重组子提取质粒，采用双酶切(EcoRI/SalI)的方法对重组质粒进行鉴定。1.2.5重组蛋白在大肠杆菌细胞中的诱导表达、检测及表达条件的优化也鉴定正确的表达质粒转化入BL21感受态细胞,进行诱导表达，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。当OD值达到0.8时，以1mmol/LIPTG诱导4h(培养条件同血,取诱导后菌液1mL,按常规方法处理样品后，进行

13、PAGE电泳,并用同样方法处理正常的BL21感受态细胞作为阴性对照。1.2.6蛋白印迹检测(Westernblot)将SDS-PAGE的电泳产物转移至硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂乳封闭，用犬细小病毒的阳性血清作为一抗，以碱性磷酸酶标记的羊抗犬的IgG作为二抗，经NBT和BCIP显色，观察特异性条带。2结果与分析2.1VP2基因的克隆以处理过的病料DNA为模板，应用引物P1和P2,进行PCR扩增，得到1条与预计大小相符的DNA片断(图1)。将PCR得到的目的基因片段，连接到pMD-18-T载体上，构建出克隆质粒pMD-18-VP2,并用PCR酶切和进行初步鉴定(图23)。鉴定正确后，送至测序公司

14、进行测序。,1755bp,1755bpM122000bplOOObp750bp500bp250bplOObp图1目的片段的PCR结果2000bplOOObp750bp500bp250bplOObp2000bplOOObp750bp500bp250bplOObp1755bpM12000bplOOObp750bp500bp250bplOObp1755bpM:DL-2000Markerl,2：pMD-l8-VP2PCR鉴定结果图2克隆质粒pMD-18-VP2PCR鉴定23VP2基因序列测定与Genebank中所列基因相比较，基因符合率为98.7%99.7%,表明克隆基因为所需要的目的基因。2.4原核

15、表达载体的构建及签定鉴定正确的质粒pMD18-T-VP2,经EcoRI和SalI双酶切、连接至pGEX-6P-l载体，重组质粒经EcoRM：DL-2000Markerl：pMD-18-VP2鉴定结果图3克隆质粒pMD-18-VP2酶切鉴定I和SalI双酶切筛选鉴定连入NPY阳性克隆(图4)。获得重组表达载体命名为pGEX-6P-VP2。2.5融合蛋白在E.coli中表达pGEX-6P-VP2(BL21)的诱导产物经SDS-PAGE分析表明，在相对分子量约为90KD的VP2基因得以表达(图5)。2000bplOOObp750bp500bp250bplOObpM1116.0kD66.2kD45.0

16、kD35.0kD25.0kD18.4kDJU-90kDM:DL-2000Marker;1:pGEX-6P-VP2签定结果图4重组质粒pGEX-6P-VP2酶切鉴定2.6Western-blotting检测使用犬细小病毒单克隆抗体作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗犬的IgG作为二抗，对上述表达产物进行了蛋白印迹分析,Western-blotting结果表明，重组表达产物可被单克隆抗体所识别,证明试验中所得的表12MM：标准步白分子ft：l：pGEX-6P-VP2(BL2l)未诱导pGEX-6P-VP2(BL21)诱导图6Western-blotting检测结果M：标准蛋白分子量；l,2：pGEX-6

17、P-VP2(BL21)诱导：3:pGEX-6P-VP2(BL21)未诱导；图5pGEX-3X-NPY诱导结果达产物为所需的目的蛋白(见图6)o3讨论VP2基因全长1755nt,编码584个氨基酸。VP2蛋白是CPV的主要保护性抗原，是重组抗原、表位疫苗和合成肽疫苗的首选蛋白。张成香等叫利用大肠杆菌表达系统，对VP2基因进行了克隆表达，成功的得到克隆性的VP2蛋白。通过分子生物学预测蛋白的保护性抗原表位，再经过试验证实预测表位的准确性是最经济、合理的方式LopeT等"在昆虫杆状病毒表达系统中表达了CPVVP2蛋白，10昭的表达蛋白可使犬获得良好的免疫效果。LangeveldF等叫合成的

18、位于VP2氨基端21个氨基酸内有部分重叠两段多肽，分别免疫犬，均能产生免疫保护作用。此外，杨德威等将CPVPIRESneO/VP2基因DNA疫苗免疫犬，可激发免疫力而没有致病性，表明VP2蛋白是CPV的主要保护性抗原，可以激发机体产生体液免疫。69-73.股震,刘景华.动物病毒学(2版)M.北京:科学出版社,1997:1145-1163.Invitrogen.PichiaExpressionKitM.California:Invitrogen,2002,53-58.萨母布鲁克J,拉塞尔DW,分子克隆实验指南M.黄培堂，译.(3版).北京:科学出版社2002:32-99.Seok-YoungJ,

19、EOUNG,So-JeoAH,ctal.GeneticAnalysisofVP2GeneofCanineParvovirusIsolatestnKorea(J).JVetMedScicng2008,70:719-722.张成香，程言信,李厚达.犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的高效可溶性表达J.现代生物医学进展2008,8(12):2423-2437.谢之景，夏咸柱,扈荣良，等.表达犬细小病毒VP2蛋白重蛆犬2型腺病毒的构建及察定J.病毒学报,2006,22:21&219.LopeT,CortccE,MartinezcC,etal.Recombinantvaccineforcanine

20、parvovirusindogsEJ.JVirol,1992,66(5):2748-2753.LangeveldF.Firstpeptidevaccineprovidingprotectionagainstviralinfectioninthetargetanimal.studiesofcaineparvovirusindogsJ.JVirol,1994,68(7):14065-14513.缪勤,张汇东，朱骞，等.犬细小病毒南京分株基因型分析J.俗牧与兽医,2005,37(6):20-21.郭伟，商晓桂,单同领，等.犬细小病毒上海分高株全基因的克隆及进化树分析中国动物传染病学报2009,17(

21、3):27-32.ChinchkarSR,MohanaSB,HanumantbaRN,etal.AnalysisofVP2genesequencesofCanineparvovirusisolatesinIndiafJ.ArchVirol,2006,151(9):1881-1887.DecaroN,MartellaV,DesarioC,etal.Firstdetectionofcanineparvovirustype2cinpupswithhaemorrhagicenteritisinSpainJ.JVetMedBInfectDisVetPublicHcaIth,2006,53:468-472.试验中，根据基因库CPV基因序列设计合成了1对引物，利用分子生物学技术成功地扩增并克隆了锦州地区分离株CPV的VP2基因片段，大小为1755bp。测序结果表明：该毒株与国内参考株比较g俱碱基同源性达98%以上，说明VP2基因变异相对较少，同国外9相关研究也一致*两。然后利用大肠杆菌表达系统，对VP2进行了高效的表达。同时，Western-blotting结果的表明，通过检