新型兽用疫苗佐剂的研究进展.docx

1、新型兽用疫苗佐剂的研究进展库大亮，李冬（中国农业科学院兰州珥医研究所，兰州730046）收稿日期2010-06-12文献标识码A文章编号1002-1280（2011）04-0044-05中圉分类号）8859.797摘要综述了细胞因子、脂质体、CpG及单磷酰基脂质A四种新型佐剂的特点及其国内外的研究进展。传统佐剂存在的一些缺点致使其不适合在新型疫苗中使用，因此寻找理想的新型佐剂已经成为兽用疫苗研发的关键问题之一；新型疫苗具有传统疫苗不具备的优点，但其抗原高度纯化、免疫原性较弱的不足也需要有理想的疫苗佐剂与之配合使用以增强其作用。关键词新型疫笛；佐剂；免疫应答ResearchProgressonN

2、ovelVeterinaryVaccineAdjuvantSHEDa-liang,LIDong(LanzhouVeterinaryResearchInstuule,ChineseAcademyofAgriculturalSciencestLanzhou730046；Chinn)Abstract:Thispapersummarizedthefeaturesofcytokines,liposomes,CpG,single-phosphoryllipidAandalsointroduceditsresearchprogressathomeandabroad.Itwasimperativetoinve

3、stigateandexploitpowerfuladjuvantsfornovelvaccinestoovercometheshortcomingsofconvenlionaladjuvants.Thenovelvaccineshadmoreadvantagesthanconventionalvaccines,buttheirimmunogenicilyofantigenswasgenerallyweak,whichneededadjuvanttoenhancetherole.作者简介：库大亮（】979年-）,男，硕士，研究实习员.从事动物传染病及其分子流行病学研究。E-mail：dalia

4、n矽9s通讯作者:李冬。E-mail：lidengpaulyahoo,Keywords：novelvaccine；adjuvant；immuneresponse佐剂（Adjuvant）是指与抗原同时或预先使用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的一类物质。传统普用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。铝盐佐剂应用已有七十多年历史，安全性较其他佐剂高而旦生产工艺也较为成熟，因此其成为全世界应用最广泛的一类佐剂。但铝盐佐剂也有一些缺陷例如其在诱导细胞毒性T细胞及Thl型反应中作用很有限，在同高纯度的小分子蛋白抗原共同使用时不能引起足够的抗体应答，因此铝盐在新型疫苗中的佐剂效果较差。油

5、佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗，但油佐剂不良反应严重.皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿；油类物质长期潴留于组织中不易代谢。随着基因工程亚单位疫苗、化学合成肽疫苗及DNA疫苗研究的兴起,人们发现新型疫苗有许多优点，但它们的抗原高度纯化,常常不能诱导较强的免疫应答。要使新型疫苗的缺点得到弥补，最常用的方法是以适当的佐剂与之配合使用。传统佐剂存在的缺点使它们不适合在新型疫苗中使用，因此亟需找到新型佐剂以加强新型疫苗的免疫效果。新型兽用疫苗佐剂是新近被发现具有佐剂作用0.来源广泛、价格低廉、高效低毒、作用机理研究比较清楚的佐剂。近年来国内外研究较多并有希望应用于兽用疫苗生产中的新

6、型佐剂有以下四种。1细胞因子细胞因子是由免疫反应中活化的细胞产生的能调节细胞增殖分化并诱导细胞发挥功能的高活性多功能多肽蛋白或糖蛋白。细胞因子通常与靶细胞上的受体特异结合后发挥作用，其生理学活性通过免疫调节网络起作用，即每种细胞因子可作用于多种细胞，同时每种细胞可受多种细胞因子的调节;不同细胞因子之间具有相互协同或相互制约的作用。在DNA疫苗的研制中通常把编码某些细胞因子的基因片段与特异DNA疫苗序列构建到同一载体或不同的载体上一起免疫动物。通过多年的研究，人们逐步对各种不同的细胞因子佐剂刺激机体产生的不同作用有了一个大致了解：细胞因子通过免疫调节提高抗原提呈能力，诱导并增强CTL的作用；细胞

7、因子佐剂能使机体持续产生抗体，并阻碍淋巴滤泡中生发中心的形成;细胞因子能将B细胞与外周隔绝，使抗体生成下降,从而起到阴性免疫调节作用。过去人们普遍认为IL-12是佐剂效果最好的细胞因子，研究发现IL-12抑制肿瘤细胞作用很强,并显著增强了CTL活性，同时增加内源性IFN的分泌。不同细胞因子基因作为乙肝DNA疫苗佐剂进行对比的研究发现$IL-12和IFN与HBVDNA疫苗联合使用免疫小鼠明显增强了Thl型免疫应答,提高抗HBV的表面lgG2a抗体产生，但Th2型免疫应答和IgGl抗体的产生受到明显抑制。另有研究表明集落刺激因子(GM-CSF)叮增强体液免疫应答，而R.对Thl和Th2型应答产生作

8、用的类型与其注射时间有关。例如在注射DNA疫苗前3d注射GM-CSF,主要可以诱导产生Th2型应答；在注射DNA疫苗后3d注射CM-CSF,则产生较强的Thl型应答。最近IL-7和IL-15作为关键细胞因子被应用来增强CD8T细胞的免疫记忆。记忆性T细胞群的存活和延续很大程度上依赖于IL-7。IL-7在CD8T细胞转变为记忆性T细胞当中具有决定性作用，而IL-15与产生和保持CD8记忆性T细胞有关。在DNA疫苗同编码IL-15的基因联合投递增强免疫应答来对抗小鼠布氏杆萌感染的实验中°,小鼠接种此疫苗增强了体液免疫，布氏杆菌病特异性抗体lgG2a的量超过了IgGl,脾脏细胞内IL-15

9、佐剂DNA疫苗诱导更高水平的IFN和CD8T细胞，同时对诱导CD4T细胞也有贡献，长期以来人们对细胞因子作为黏膜免疫佐剂对抗滤过型病原体给予很高期望oHiroyuki等通过比较16种不同肿瘤坏死因子的免疫应答来鉴定它们作为黏膜免疫佐剂的作用，其中APRIL、TL1A和TNF-a诱导较强免疫应答，而TL1A诱导的应答最为强烈，增高了卵清蛋白(ovalbumin.OVA)特异性IgG和IgA在血清和黏膜区域的含ht.TLIA诱导的OVA特异性免疫应答典型地提高血清IgGl,增加被免疫小鼠脾细胞产生IL-4和IL-5的量，显示TL1A有诱导产生Th2型免疫应答的作用。由此也说明TL1A具有潜在的黏膜

10、免疫佐剂功能。目前已有多种细胞因子如IL-12JL-15、IL-18、GM-CSF及1NF-y等作为病毒DNA疫苗佐剂在实践中得到应用,并有效增强了DNA疫苗的特异性免疫反应。尽管有许多研究都表明细胞因子的作用主要集中在增强Thl型应答上，但细胞因子良好的佐剂效果仍然使其成为DNA疫苗佐剂研究的热点而且目前研究显示其毒副作用很低，K期使用是否会对机体造成不良影响还有待临床检骑。2脂质体脂质体是山磷脂和固醇类组成的双层脂质分子小球，其表面为疏水结构，内部为亲水结构。脂质体易定位于肾、肝、脾等单核吞噬细胞F富的器官。巨噬细胞等吞噬了含有抗原的脂质体,经溶酶体酸消化释放抗原,可激活T细胞及B细胞。脂

11、质体既可做抗原载体又可做佐剂，用它包裹DNA疫苗到达靶细胞后，脂质体与靶细胞融合并将DNA释放入细胞进行表达。近些年对脂质体的研究是一个热点，取得的成果主要有以下儿点:具有艮好的靶向性和仓储效应;增强体液免疫应答和细胞免疫应答;增强巨噬细胞的吞噬作用，增强抗原提成作用®；与A1(OH)3及CpG-ODN等佐剂协同作用，可更好地提高免疫效应；可作为一种有效的黏膜免疫递药系统。有研究认为脂质体作为肿瘤疫苗佐剂，在将肿瘤抗原提供给抗原递呈细胞及诱导抗肿瘤应答方面有很强的作用。另有研究表明脂质体与包埋于其内的DNA和蛋白质联合使用.其免疫效果远远超过了原来脂质体加质粒DNA的经典疫苗,这种新

12、方法叫做联合投递。在联合投递中DNA由MHCclass-I分子递呈，蛋白质由MHCclass-II分子递呈，分别激活CD8T细胞和CD4T细胞，联合投递作为一种新技术将会有广阔的前景。Okuda等用阳离子脂质体包裹HIV-1质粒DNA,接种亲代小鼠后发现胚胎中含有HIV-1质粒,其后代经DNA疫苗免疫后可诱导产生更强的免疫应答，此实验表明脂质体与HIV-】DNA联合接种后的亲代可以把特异性免疫传给后代。类病毒颗粒（Virosome）,5是在脂质体的基础上发展起来的一种抗原输送技术。将流感病毒的血凝素和神经氨酸酶的部分氛基酸序列定向地插入双层脂质球的膜中，使这两种分子中能与宿主免疫细胞表面的受体

13、结合的基团暴露在表面，将抗原或编码抗原的DNA包裹在内部，由F这种脂质球刈细胞的主动亲和作用，在形式上近似于病毒与宿主细胞的作用过程，因而被称作类病毒颗粒。其优点是有利于抗原或药物分子的定向传输。利用该技术制备的流感疫苗已经在临床上发挥很好的免疫保护作用。脂质体在宿主体内可生物降解，本身无毒，不会引起宿主发生变态反应和自身免疫病。但是脂质体也存在着诸如对宿主体内某些酶敏感因而不稳定;合成比较困难，因此生产成本较高；有轻微的不良反应等缺点,还有待进一步研究和解决。3CpG-ODN佐剂很久以前人们就发现高等生物进化过程中逐渐形成了对入侵微生物的天然识别机制，能够被高等生物免疫系统识别的病原成分中就

14、包括细荫和病毒的DNA，而CpG-ODN是含有非甲基化CpG胞嗜陇鸟嚓吟二核廿酸的脱氧核皆酸°相比较而言，非甲基化的CpG在细菌DNA中更普遍，而在脊椎动物DNA中很少见，也更易引起脊椎动物的免疫反应。CpG对鼠类和人类B细胞能直接刺激和诱导有丝分裂，诱导细胞因子产生、免疫球蛋白分泌及细胞凋亡;CpC也直接激活巨噬细胞产生炎性细胞因子IL-12,增加B7-1和B7-2水平，刺激抗原特异性T细胞活性;CpC活化NK细胞产生干扰素，增加细胞溶解作用。根据功能不同可把CpG-ODN分为A、B、C三个类型。A型有效的活化NK细胞和1FN,但对B细胞刺激作用有限;E型有很强的B细胞刺激作用，但

15、对NK细胞和IFN作用有限;C型兼有A、B型的作用。B型刺激B细胞增殖有一定的规则，即嗦吟-噤吟-CG-唏陇-倒®例如较理想的模式是在鼠GACGTT序列效果较好，而在人和其他如牛、羊、猫、狗、山羊、马、猪、鸡则GTCCTT序列效果较好°免疫刺激作用不仅限于六聚CpG模式，也包括其他模式!戚：CpC在ODN中的数地,23个比较理想；®CpG模式间的间隔，至少被两个插入序列，最好是T间隔；ODN中含有polyG或者其他序列;ODN的磷硫酰骨架敞好要有活性;如果5,端有TpC,3'端富含嗜咬,则免疫剌激作用更强CCpG-OD、被认为是目前作用机理研究最清楚的一种

16、佐剂，CpG-ODN在与淋巴细胞表面的DNA黏合蛋白绑定后进入了细胞内涵体，内涵体可以作为CpG的起始识别信号,TLR9特异识别CpG,然后作用于PRRs,引起先天免疫应答，通过识别病原特殊分子模式来对抗病原体TLR9在B细胞和树突状细胞中表达量最高，这两种细胞也是直接由CpG诱导激活的细胞,TLR9基因敲除小鼠的研究显示B细胞、DC细胞、NK细胞无CpG刺激活性。CpG能有效激活巨噬细胞.有效增加TNF-a和IL1B、】L-6、】L-12及抗原递呈分子如MHCclass-II分子、CD80、CD86、CD40等*、CpG通过激发产生IFN-y而使NK细胞被诱导。CpG没有显示出直接刺激NK细

17、胞或静止期的T细胞的功能，在鼠类可以通过CpG诱导产生1型1FN来间接剌激T细胞。CpG对于Thl样应答具有良好的作用，皮F注射CpG可以增加组织器官的Thl样应答，在710d到达顶峰,树突状细胞在淋巴结显著增加，而旦这种应答可以在小鼠持续很多周CpG也诱发IFN）依赖性Ig（；2a抗体优先保护并促进抗原特异性细胞毒性T细胞增值，使免疫应答达到顶点,从而保护健康动物对抗病原感染。在利氏曼原虫疫苗接种小鼠的实验中），添加CpG组增加的IFN因子分泌细胞、CD4T细胞和CD8T细胞使保护率较未添加组提高23倍。近年来许多实验室一致发现，蛋白抗原与CpG-ODN合并用阳离子脂质体投递，可以被专业抗原

18、递呈细胞优先获取，其结果是与CpG-ODN和蛋白抗原宜接混合投递相比增强了细胞毒性T细胞的应答。Jason等23,报道了一种包含CpG和人造阳高于先天防御调节器缩氨酸（HH2）的CpG-H112复合体。CpG-HH2复合体是一种有效的细胞因子和超化因子刺激物，可以长期在体内保持活性，并旦只有很低的毒性。其作为佐剂的主要作用是控制树突状细胞表面受体的表达。这种复合物与用日咳类毒素共同免疫小鼠，产生的类母素特异性抗体含楚高于单独使用类毒索组,且诱导更高滴度的IgCl和IgG2a,典型性平衡了Thl/Th2型应答，也诱导较高水平的IgA滴度。CpG作为DNA疫苗佐剂具有明显的免疫调节作用,可增强质粒

19、编码抗原的体液和细胞免疫反应，所以被看作一种很有前途的免疫佐剂。动物实验和人类的临床使用都表明24l,CpG-ODN在肿瘤治疗和传染性疾病预防中是一种强有力的Th1型免疫刺激物。有报道称在狂犬病疫苗中分别添加CpG-ODN和铝盐佐剂对小鼠进行注射，发现CpG-ODN佐剂疫苗注射3次产生的抗体含砒与铝盐疫苗注射5次产生的抗体含量相当，可见CpG-ODN佐剂疫苗在抗狂犬病病毒保护方面有更好的效果。另有报道认为°,用药途径的不同会强烈影响CpG-ODN诱导的免疫反应,皮下注射能引发Thl型免疫应答并使IL-6JL-12和IFN-a等因了表达上调，而静脉给约会抑制T细胞应答和CTL活性。许多

20、病原菌入侵宿主通过呼吸道、消化道、生殖道黏膜，如果CpG能增强黏膜免疫,则会取得很好的效果。有实验表明将CpG同甲醛灭活的流感病毒混合,鼻内免疫小鼠，可以增加血清、唾液和生殖道中流感特异性抗体水平；同样CpG同其他黏膜疫苗联用，可以增强黏膜免疫系统抗原特异性IgA和IgG应答。4单磷酰基脂质A单磷酰基脂质A（MonophosphoryllipidA,MPLA）是革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（LPS）的一部分。70年代Edgar等系统研究了LPS的性质并用沙门氏菌的LPS水解得到MPLA,他们发现MP14对患肿瘤的儿内亚猪有保护作用，而其毒性只占LPS的0.08%。近年来，人们做了很多工作来验证E

21、dgar的工作。IL-lb是一种促炎症因子，在小鼠的研究W中,MPLA强烈刺激IL-lb的mRNA翻译,相似的模式在后来研究中再次发现，小鼠脾脏在注射MPLA后强烈表达IL-lb,但血清中1L-11）含量相比注射LPS组小鼠要低很多。由此可知MPLA与LPS同样具有刺激促炎症因子IL-lb的作用，但MPLA作用下IL-lb只被限制在特定部位起作用。另一个证明MPLA仅具有低毒性的例子是它刺激高水平的IL-10（IL-10是一种抗炎症细胞因子，IL-10产生可限制炎症因子如IFNg的表达）。有报道称"MPLA可以刺激TLR2和TLR4,而这两种受体都有刺激IL-10的能力，从而减少了炎

22、症反应免疫应答。还有一个证据'犯是MPLA具有抑制炎症环境的功能，在小鼠肺部病例模型中，MPLA同甲醛灭活呼吸道合胞病毒（RSV）共同投递表现出防止过度炎性反应的功能。实验显示MPLA不仅仅影响免疫应答的类型，而且抑制许多促炎症反应成分的作用。实验显示在同RSV共用时MPLA减少RSV融合蛋白刺激TLR4的敏感性，而RSV融合蛋白是一种很强的炎症刺激物。尽管机理并不十分清楚，但这项研究表明在特定情况下，MPLA可以激活适度的免疫应答。疫苗中使用的MPLA称作MPL佐剂。通过兔子发热试验测试，其毒性是LPS的0.1%,同Edgar早期试验完全吻合，而其作用完全可以取代铝盐和其他疫苗添加物

23、。MPL佐剂目前在许多疫苗中使用。最广泛被使用的有三种佐剂系统，分别是ASO1、ASO2和AS（X3；0其中ASO4被认为是缺点最少的一种，它由氢氧.化铝或磷酸铝盐吸附MPL佐剂制成.ASO4已被用于乙型肝炎FENDrix疫苗和官颈癌Cervarix疫苗中，为人类在乙肝病逐和人乳头瘤病毒感染中提供免疫保护；ASO2是油水乳液中添加MPL和一种三祜烯葡糖样制成，被尝试用作保护疟疾感染，试验证明ASO2刺激CD8T细胞的作用强于ASO4；ASO1是脂质体中混合了MPL和QS21佐剂制成，其佐剂效果很好,但是副作用较大。以上这些疫苗已大量用于临床试验次，不艮反应发生频率与铝盐佐剂单独使用时相当。MP

24、L佐剂因其有益的部分被保留而有害的部分被遗弃或有效得到控制，已经作为一种安全的疫苗佐剂在欧洲和澳大利亚上市。5小结本文选取的四类新型兽用疫苗佐剂是经过多年的研究，得到学者们公认的毒副作用较小而佐剂作用相对较好的有应用前途的佐剂。理想的兽用疫苗佐剂应当有这样一些特征：对于特定的动物，要保证副作用最小；佐剂作用要持久稳定；生产成本要尽址低；产生的免疫应答应适当，也就是说细胞或体液免疫的强度要能达到保护要求；不同用药途径产生的不同毒副作用都应当研究清楚并注明。任何一种佐剂都有毒副作用，而目.越有效的佐剂常常伴有越严重的毒副作用，所以佐剂与疫苗配合使用一定要注意在佐剂的优点和其产生的不利反应之间选取一

25、个平衡点。随着研究的深入，今后兽用疫苗佐剂研究的方向应该是：一方面进一步从先天性免疫及获得性免疫方而对已知的佐剂作用机理在分子免疫水平进行研究，尽可能详细地掌握作用机理；另一方面寻找其他高效低毒的新型免疫佐剂。参考文献:1HarandiAM.MrdagliniI),ShattockRJ.VaccineAdjuvants:APriorityforVaccineResearchJJ.Vaccine12010,28(12)：2363-2366.2,Laddy1)J,WeinerDB.FromPlasmidsIoProtection:aReviewofDNAVaccinesagainstInfecti

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