烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定.docx

1、生物技术林世锋,王仁刚,任学良,等：烟草种质资源抗马铃藉Y病毒病基因型鉴定中国烟草学报,2021,27(5).UNShifeng,WANGRengang,RENXueliung,etal.GenotypicidentificationofPotatovirusYresistanceintobaccogermplasmresources/.ActaTabacariaSinica,2021,27(5).doi:10.16472/j.chinatobacco.2020.342烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定林世锋I,王仁刚七任学良I,李尊强2,元野2,龙明锦1,张吉顺】，王自力】I贵州省烟草科

2、学研究院，烟草行业分r遗传重点实验室，贵阳市观山湖区龙滩坝路29号550081：2中国烟草总公司黑龙江省烟草公司牡丹江烟草科学研究所，哈尔滨市道里区哈药路17号150076摘要：【背景和目的】从作物种质资源中进行等位基因鉴定，特别是优异等位基因的发掘和应用，是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。【方法】采用苗期汁液摩擦接种的方法，对烟草种质资源的马铃薯Y病毒(PmasvirusY,PVY)抗病性进行鉴定；通过烟草隐性抗PVY基因eIF4El(又称为感PVY基因elF4Eh等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序，对PVY抗病资源进行基因型分析。【结果】(1)从收集到的900多

3、份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。(2)根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4El基因所控制。(3)等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的elF4El基因区分为4种突变类型。【结论】本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容，为后续烟草PVY抗性优异籍位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撞。关键词：烟草：种质资源：马铃薯Y病毒：抗病性；C1F4E1基因；基因型由马铃薯Y病毒(PolciU)virusY,PVY)引起的烟草PVY病毒病是影响烟草生产的主要病害之一。实践证明，选育和种植抗病品种是控制该病害

4、最经济有效的措施IUo抗病种质资源的发掘、研究和利用是烟草抗PVY育种的重要基础。已知烟草PVY的抗源分为两大类，一类是以VAM(TII406)及其衍生种质TN86为代表的隐性基因位点("M和“)控制的抗性口3】，另一类是以非洲烟草(Nicolicmaafricana)为代表的对PVY免疫的抗性叫。目前，受四位点控制的抗源被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高肱位点的育种利用效率，国内外研究者相继开发了与w位点相关的分子标记，如RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)和SequenceCharacterizedAmplifiedRegion(SCAR)标

5、i己”'I。这些标记与m位点间的遗传距离较远，导致利用标记数据判断抗性表型误差较大，进而限制了这类分子标记在育种中的实际应用。在抗性获得的研究中，Noguchis等151认为va基因型烟草植株的抗性是由于对PVY感病的基因片段的缺失造成的。2014年，Julio等通过更加深入的研究，进一步明确了m基因型烟草植株对PVY的抗性是由于真核翻译起始因子4E1(eukaryotictranslationinitiationfactor4E1,elF4El)基因的缺失造成的，即eIF4El基因为烟草隐性抗PVY基因(感病基因)。2015年，刘勇等剧根据烟草CIF4E1基因及其家族基因的序列信息，

6、开发出一个与eIF4El野生型等位基因紧密连锁的显性标记，随后利用该标记进行分子标记辅助选择育成抗PVY新品种云烟基金项目：中国烟草总公司贵州省公司科技项FI“贵卅特有种质PVY抗性共显性分子标记开发及双抗病毒病材料创制”(201901):中国烟草总公司贵州省公司科技项目“美国北卡罗莱纳烤烟新品种(系)的引进、爵选和应用”(201830:中田烟草总公司贵州省公司科技项目“贵州烤烟种质创制及新品种选育研充”(201601):中国烟草总公司黑龙江省公司科技项目“龙江烟区早熟、多抗烤烟新品种选有及示范推广"(202030000200126)作者简介：林世锋(1978),博上，副研究员，主要

7、研究方向为烟草遗传育种与分子生物学，TelEmiiil：Iinshifcngl978通讯作者:王仁刚(1976),TelEmail：rengangwang收稿日期：202812-25；网络出版日期:2021-06-18301110',但由于该标记不能作为eIF4El等位基因缺失的共显性标记，降低了其在实际育种中的应用价值和意义。2018年，Dluge等叫利用RNA测序的方法比较了基因型、旧基因型和野生型三种烟草中的基因表达差异，发现在具有PVY抗性的VAM和w基因型烟草中，真核翻译起始因子eIF4El基因所在的染色体区段发生大

8、范围的缺失，由于建立eIF4El等位基因缺失的共显性标记需要了解该基因缺失连接片段的序列特点，而elF4El基因及其侧翼序列的大范围缺失，造成研究者未能有效地克隆到该基因的缺失连接片段、获得序列信息，从而未能开发出等位基因缺失的共显性标记。作物种质资源中蕴含着大量优异等位基因，如何鉴定并将这些变异应用于作物遗传改良是种质资源研究的中心任务之一【。先前研究结果表明，在烟草种质中存在一定数量的PVY抗性资源，但有关种质资源基因型，特别是有关烟草eIF4El优异等位基因及其特异分了标记的研究报道甚少l,3-,5|o本研究目的是鉴定收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源的PVY抗性表型，并通过抗性

9、基因等位性测验和RT-PCR扩增测序相结合的方法，分析筛选出的抗源材料所携带的elF4El基因的基因型，以期为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供基础材料和信息支撑。1材料与方法1.1试验材料供试种质由贵州省烟草科学研究院提供，其中包括PVY抗病对照烟草品种TN90和感病对照烟草品种K326。以TN90和K326作母本与研究中筛选到的PVY抗病资源作父本进行杂交获得F1代杂交种材料，用于抗病资源中PVY抗性基因的等位性检洲。1.2PVY人工接种以普遍发生的脉坏死株系（PVYN）为接种毒源，由贵州省烟草科学研究院品种选育三室分离和保存。抗PVY测试采用常规汁液摩擦接种法,6,o1.

10、3烟草基因组DNA的提取采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒（Axygen）提取烟草基因组DNA,并通过紫外分光光度法（Nanodrop）和琼脂糖凝胶电泳法初步检测基因组DNA的提取质量。1.4烟草RNA提取和cDNA合成采用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取总RNA“cDNA第一链的合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptII1ststrandcDNASynthesisKit说明书进行。1.5烟草e!F4El基因的特异分子标记检测根据文献报道合成eIF4El野生型等位基因的5,端显性分子标记引物、开阳小黑烟和福泉柳叶烟elF4El突变型等位基因的共显性分子标记引

11、物”"别如*前酸还霸因）的特异性引物19,同时设计合成ejp4£j野生型等位基因的3,端显性分子标记引物（表1）,对筛选到的PVY抗病资源中的曰基因进行PCR扩增试验。1.6烟草e!F4El基因的全长cDNA扩增根据文献20合成e!F4El基因全长序列扩增引物（表I）,以各自烟草cDNA为模板扩增eIF4El基因全长cDNA序列。PCR扩增体系：TaKaRaLATaq酶0.25pL,I0XLATaqBuferH2.5pL,dNTPMix2pL,正向引物（lOpmol/L）1gL,反向引物（10pmol/L）1pL,模板1pL,加入ddHQ补平至25pLoPCR扩增程序：94

12、C预变性3min,94°C变性30s,94°C变性30s,52'C退火30s,72°C延伸1min（30个循环），最后72°C延伸10min。PCR产物电泳检测，送上海生工公司进行基因测序。表1本研究所用引物序列Tab.1Primersusedinthisstudy引物用途引物名称引物序列（5r-39elF4El野生型等位基因CF2TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT5*端显性分子标记GRIIGAAGGCAAGATATTCAGGAGCT内引物ACGGCACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTAG开阳小黑烟elF4El突变型内引物

13、BGAATATGAAATAACTTACCCCCAAAAACT等位基因共显性分子标记外引物PCAAGTACCCTTTTCCTACTAAAATCTATAACTAAG外引物QGCCGGACAGAATTAGTGTCACATAAAATTGAAGATTTTAC续表1引物用途引物名称引物序列（5,3）福泉柳叶烟HF4E1'突变型等位基因共显性分子标记公共正向弓1物CCCATTTGACACCATAAGTTCATACG野生型反向弓1物AAACACTGTTTGCAGAATTTAAGCAAC突变型反向引物GGAGTATGATCTAGACGAAGTATCTCTTGACTACelF4El野生型等位基因3,端显性

14、分子标记3'-FAATTCGTGCCACGTTAGGGC3'-RTTGAGTCGTCCTGCAATTTGCelF4El基因全长cDNA序列扩增eIF4EI-FCTAAAATCTATAACTAAGTACATAGAAAACACACGelF4E1-RGGTACTTAAACTGTCAAGTGGCAGC内参基因NR序列扩增NR-FCGCTGATAACTGGATTGAACGCNR-FGGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC2结果2.1抗性表型鉴定从900多份种质资源中，通过苗期盆栽人工接种PVY抗性鉴定，获得抗PVY资源开阳小黑烟、半坤村晒烟等19份（表2）。抗PVY资源大部分属

15、于我国地方性哂烟及黄花烟品种。表2抗PVY的烟草种质资源信息Tab.2TheinformationofthetobaccogermplasmresourcewithresistancetoPVY编号种质名称种质类型抗性基因型编号种质名称种质类型抗性基因型1开阳小黑烟晒烟R单碱基插入11C15I烤烟R完全缺失2坝林晒烟晒烟R单碱基插入12NC55烤烟R完全缺失3光柄柳叶（木）晒烟R单碱基插入13TN86白肋烟R完全缺失4一朵花晒烟R单碱基插入14Havana10雪茄烟R完全缺失5励海乡晒烟（二）晒烟R单碱基插入15CriodlloSalteno11雪茄烟R完全缺失6盘县大柳叶晒烟R单碱基插入16

16、陕县兰花烟黄花烟R完全缺失7册亨威旁土烟晒烟R单碱基插入17灵宝莫合烟黄花烟R完全缺失8半坤村晒烟晒烟R单碱基替换18建平大兰花烟黄花烟R完全缺失9福泉柳叶烟晒烟R部分缺失19茄子烟黄花烟R完全缺失10普安付耳烟（3）晒烟R完全缺失20K326烤烟S野生型2.2与TN90抗病位点的等位性检测己知白肋烟品种TN90对PVY的抗性是由隐性基因位点（知）控制的，具体而言是由烟草PVY感病基因e/F4El缺失造成的山、为检测抗PVY资源与TN90对PVY抗性间的等位性关系，利用抗PVY资源与TN90及感病品种K326配制抗抗及抗感杂交组合，各选取60个R代单株，通过人工摩擦接种法进行鉴定。结果显示，1

17、9份抗PVY资源与TN90配制抗抗组合的F.代单株均表现为抗病，而19份抗PVY资源与K326配制抗感组合的Fi代单株均表现为感病。上述结果表明，筛选到的19份抗PVY资源与TN90的PVY抗病基因间具有等位性，即推断19份抗PVY资源的PVY抗性均是由感病基因eIF4EI缺失造成的。2.3eIF4El基因的特异分子标记检测近年来研究发现烟草抗PVY材料的eIF4El基因可发生数种不同形式的突变，包括最为常见的基因全序列缺失突变（山，及单碱基插入和大片段缺失突变等IB20；相继开发了不同的分子标记，包括烟草eIF4El野生型等位基因5,端显性分子标记、开阳小黑烟elF4El突变型等位基因共显性

18、分子标记明和福泉柳叶烟eIF4El突变型等位基因共显性分子标记"8|,这些分子标记的相对位置如图I所示.考虑到上述分了标记的检测范围未能涵盖烟草elF4El基因3,端，本研究另外在烟草eIF4El基因3,端设计了烟草"F4E1野生型等位基因3,端显性分了标记（图1）。接着本研究利用4种分子标记引物对19份抗PVY资源和1份感PVY资源进行PCR扩增试验，结果显示，4种分子标记将20份资源区分为4个标记基因型（图2）o标记基因型A包括开阳小黑烟、坝林晒烟、光柄柳叶（木）、一朵花、励海乡晒烟（二）、盘县大柳叶和册亨威旁土烟共7份抗病资源。标记基因型B包括半坤村晒烟和K326,其

19、中半坤村晒烟表型鉴定为抗PVY,K326表型鉴定为感PVYo标记基因型C只包括抗PVY资源福泉柳叶烟，已知福泉柳叶烟eIF4El基因3,端发生大片段缺失（部分缺失）mi。标记基因型D包括普安付耳烟（3）、C151、NC55、TN86、Havana10、CriodlloSaltcno1K陕县兰花烟、灵宝莫合烟、茄子烟、建平大兰花烟共10份抗病资源，利用4种分子标记引物扩增均未产生任何条带，初步推测这10份抗病资源elF4El基因发生了完全缺失。ATGTAG注：图中上方黑色方框代表烟草dF4E!基因外显子，方框之间的线段代表内含子：下方双向箭头代表烟草etl-4El基因的不同分子标记，I代表烟草e

20、lF4EI野生型等位基因5,端显性分子标记，2-I/2-2代表开阳小黑烟elF4EI突变型等位基因共显性分子标记，3-1/3-2代表福泉柳叶烟e!F4El突变型等位基因共显性分子标记，4代表烟草elF4EI野生型等位基因3,端显性分子标记。图1烟草UF4E1基因的4种分子标记在基因组上的相对位置示意图Fig.IRelativepositionsoffourmolecularmarkersoftobaccoelF4EIgeneinthegenome注：（a）烟草WR/E/野生型等位基因5端显性分子标记检测结果：（b）开阳小黑烟WF4E/突变型等位基因共显性分子标记检测结果：（c）福泉柳叶烟C1F

21、4E1突变型等位基因共显性分子标记检测结果：（d）烟草elF4El野生型等位基因31端显性分子标记检测结果：（c）内参基因Actin扩增结果：M：DL2000DNAMarker：1-20：烟草种质资源（见表2）:S：标记在感病品种中扩增出的特异性条带：R：标记在抗病品种中扩增出的特异性条带：A、B、C、D：，个标记基因型。图2抗PVY烟草种质资源中基因的分子标记检删Fig.2MolecularmarkerdetectionofelF4ElgeneintobaccogermplasmresourcesrcsistanitoPVY2.4C1F4E1基因的RT-PCR扩增及序列分析应用RT-PCR技

22、术对19份抗PVY资源的eIF4El基因进行RT-PCR扩增和序列测定，结果显示，在福泉柳叶烟、普安付耳烟（3）、C151、NC55、TN86、Havana10、CriodlloSahenoII、陕县兰花烟、灵宝莫合烟、茄子烟和建平大兰花烟等11份种质资源中未能扩增出eIF4El基因的全长cDNA序列（图3）,己知在福泉柳叶烟中elF4El基因发生3,端大片段缺失（该种突变型等位基因被命名为CIF4E1.F）,结合e!F4EI基因的特异分子标记检测结果，推测其他10份种质资源中elF4El基因发生了完全缺失；在开阳小黑烟、坝林晒烟、光柄柳叶（木）、一朵花、胡海乡I晒烟（二）、盘县大柳叶和册亨威

23、旁土烟等7份种质资源中均能扩增出两个大小不同的条带（图3）,进一步测序显示eIF4El基因在这些资源中存在两种剪接模式（图4）,其原因在于eIF4El基因I号外显子3端发生单-碱基（T）插入突变影响到部分前体RNA内含子1的正确剪接（GT-AG法则）,导致下游2号外显了发生跳跃缺失突变，考虑到此种突变型等位基因最初在开阳小黑烟中被发现，故将其命名为e/F4时您少：与上述elF4EI基因突变类型不同，在半坤村晒烟中可以扩增出与感病品种K326一样的单一条带（图3）,测序结果显示，半坤村哂烟的eIF4El基因编码区（CDS）第149位碱基处存在一个等位基因突变，即由G突变为C（图4）,从而导致相应

24、编码的蛋白质第50位氨基酸残基由色氨酸（W）突变为丝氨酸（S）,为将半坤村晒烟中发现的e!F4El突变型等位基因与其他突变型等位基因区分开来，我们将半坤村哂烟中发现的eIF4EI突变型等位基因命名为HF4E1.B。M1234567891011121314151617181920注：（a）烟草elF4EI«因的全长cDNA序列扩增：（b）内参基因NR扩增，用以保证每个PCR反应使用了等最的cDNA模板：Ml：DL2000DNAmarker；1-20：烟草种质资源（表2）,图3烟草eIF4El基因的全RcDNA序列的PCR扩增Fig.3PCRamplificationofthefull-

25、lengthcDNAsequenceofelF4Elgeneintobacco3讨论温室盆栽苗期人工接种鉴定结果，19份烟草种质资源对PVY表现为高抗，其中开阳小黑烟、坝林晒烟、半坤村晒烟、福泉柳叶烟、C151、NC55、TN86Havana10>CriodlloSalteno11陕县兰花烟、灵宝莫合烟、建平大兰花烟等12份资源PVY抗性在先前文献中已有报道19,13,15,18.20，但除开阳小黑烟、福泉柳叶烟、C151、NC55和TN86等5份种质资源外,对其他种质资源中PVY感病基因elF4El的基因型未见报道。己知目前烟草育种利用的PVY抗源可能全部衍生自烟草资源VAM,利用VA

26、M抗源及其衍生抗源育成的抗PVY烟草品种包括白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC744、NC55、NC102等，但是在这些抗源及育成的抗病品种中往往围绕着eIF4El基因及其侧翼序列的染色体区域发生了大范围的缺失，其中涵盖上百个基因的缺失""o上述染色体区域的大范围缺失及无法获得缺失连接片段序列信息不仅造成eIF4El基因位点野生型和突变型共显性分子标记难以开发，不利于隐性性状的选择，而且也会由于一些功能基因的缺失带来不利的农艺性状。早有研究报道，VAM基因型抗源材料的PVY抗性存在连锁累赘，如叶片短小、产量较低、缺乏叶面分泌物等【22-马。这些连锁累赘现象可能与eI

27、F4EI基因上下游大量功能基因的缺失相关，因此即使针对这类抗源材料设计出共显性标记用于回交育种辅助选择或增加回交次数，也无法打破PVY抗性定向改良带来的连锁累赘。为克服或避开上述问题的困扰，本研究从鉴定烟草种质资源抗PVY表型和基因型入手，通过分析发现所有筛选到的抗病资源无一例外在elF4El基因位cIF4El.SelFIEl.BOIF4E1.K1oIF4El.K2elHEl.SelFIEl.BO1E4E1.K1eIF4El.K2cIF4El.SeIF4El.BelHEl.KleIF4El.K2696970512222eIF4El.SelFIEl.BeIF4El.KIoIF4El.K29901

28、55653332wjUuSSStfusShiggcaatgaiiggacaicaaiijgaicalist1uxl>icLuuxUJJ29LJjauxM1''，、ieiu11.iiu.,i.曲3祁且剧3曲日觅朗I(CAATGU1(XxACATlAAI1(«AIelHEl.SelFIEl.BelFlEl.Kl©1F4E1.K299043347555390909090elHEl.SelFIEl.BelHEl.KleIF4El.K2ICGTCGTATTTGGGCJi*i：i.IGAAATCAAEAAG(:ATCCATT.AGAilAATTCIT|.(TTTT

29、T<TTGATAAT卬TAT(XX：TAAAiCGTCGTATTTGGGCji,ii：t/ifflAAGCuccniv：;、11(r?j(TTTTTi1'>>'11(1GM1CGTCG：ATTTJIG(i*1：i；lCITA.h(iicc.'.rrv：;iAATTCTTiBACnTTriitgataaTUt.atggci.ICGTCGTATTTGGGCJii:©AAATCAALCCTAAGCATCCATTAGA<SAATTCTtACTTTrria；TTTGATAATCCTATGGCTAAA180180180180elMEl.SeIF4E

30、l.B©IF4E1.K1eIF4El.K2161CAGAGGTGCCAACAATCGTTATACAGTATAG(GA«；TGCCAA(；AAtCOTTATACAGTATAGGG,©；T氐CMGAA忡CTTATACAGTAT而:MIU'Igccm(；aatc(;ttmacagtm.g666660660661495elHEl.SelHEl.BeIF4El.KlCIE1E1.K2注：e!F4EI.S：野生型等位基因序列：elF4El.B,e!F4El.K<elF4El.KI和eIF4EI.K2):突变型等位基因序列.图4烟草elF4El野生型与突变型等位基

31、因的全长cDNA序列比对Fig.4Alignmentofthefull-lengthcDNAsequencesofwild-typeandmutantallelesofelF4EIintobacco点发生了不同类型的突变，其中筛选到的晒烟和黄花烟抗病资源均是我国地方品种(又称农家品种)，是经过长期的自然繁衍、淘汰及人工驯化选择的结果，不涉及人工诱变或基因修饰。尽管筛选到的所有抗病农家品种均是由于eIF4EI基因位点发生自然突变造成的结果，还不能说明elF4El基因是烟草抗PVY的唯一机制，但可能表明elF4El基因位点是目前进行烟草抗PVY品种选育的最佳靶向位点，不会对其他农艺性状带来负面效应

32、或带来的负面效应相对较小，同时利用筛选到的elF4El单个基因突变的抗病资源(如开阳小黑烟或半坤村晒烟)也可能消除或减小围绕C1F4E1基因位点发生大量基因缺失突变的抗病资源(如TN90或NC55)作为供体亲本带来的负面效应。然而，需要指出的是，近年来，国内外学者先后在烟草上发现了多个能够突破elF4E/基因型抗性的PVY毒株12427,于此同时，在烟草中发现了与之对应的新的隐性抗病基因eIF(iso)4EN°因此，今后如果能够针对两个隐性抗病基因eIF4El和eJF(iso)4E-T进行烟草种质资源抗PVY优异等位变异的挖掘和聚合育种，势必可以创制出赋予烟草对绝大多数PVY病毒株系

33、抗性的新品种仅气回交育种对带有个别不良性状的品种改良是一种较好的育种途径，而分子标记辅助选择(MAS)因其对目标基因的快速准确选择为回交育种提供有效工具a】。由J-eiF4El基因是隐性抗病基因，在以选择杂合个体为目标的回交转育过程中，以扩增elF4El野生型等位基因为目标的显性分子标记不能有效识别含有eIF4El突变型等位基因的杂合个体，仍需通过逐代测交或自交的方法鉴定基因型，不尽完美。鉴于共显性的分子标记允许在回交转育杂合体阶段进行隐性基因的鉴定，无需进行测交或自交检验，节省选育时间，本研究对烟草种质资源抗PVY表型和基因型进行鉴定，筛选到多个新的抗病资源，并获得了各个抗病资源elF4El

34、基因突变序列信息，为建立烟草PVY隐性抗病基因elF4El的共显性分子标记提供了可能，为提高烟草PVY抗病育种选择效率，加快品种改良进程奠定了基础。4结论本研究从900多份烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源，其中14份为中国烟草地方品种资源。通过抗性基因等位性测验，初步推断19份抗源的PVYn抗性由隐性抗病基因e/F4引所控制。通过序列分析，确定19份抗源中eIF4El基因存在4种突变类型，包括单碱基插入、普换、基因片段部分或完全缺失。这些结果为烟草PVY抗病育种中抗病材料的选择提供了依据，也为烟草抗PVY共显性分子标记的开发和应用提供了可能，从而有利于提高育种效率，加快育种进程。参考文

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