猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展.docx

1、猪群保健HEALTH栏目协办腾骏药业设安示涓安国家高祈技术企业猪传苗哈明成'.汤德元A李春燕1王凤匕王彬2.张晓杰七甘振磊2(1.贵州省开阳县草地生态畜牧业发展中心.贵州开阳550300,2贵州大学动物科学学院.贵州贵阳550025)摘要猪传染性胸膜肺炎是一种严重的呼吸系统疾病,该病自1957年在英国的Pattison等首次报道以来,已在全世界大多数养猪国家流行，并对养猪业造成了巨大的损失。据报道，我国于上世纪80年代从国外进口种猪时传入该病.根据血清学和病原学调查表明:该病已在我国各大省市普遍存在.而且近年来有加剧的趋势。由于该病的治疗难度较大，多数情况下难以完全治愈.因而采用疫苗预

2、防控制显得尤为重要。目前，猪传染性胸膜肺炎疫苗无论是己经商品化的灭活疫苗和亚单位疫苗.还是国内外已经报道的一些基因工程减毒活疫苗，对抵抗胸膜肺炎放线杆菌(APP)的效果各有不同，现对猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展进行综述.以为该病的预防提供参考。关健伺：猪传染性胸膜肺炎；常规疫苗;新型疫苗;研究进展资助项目：2009年贵州省科技计划农业攻关项目资助【编号：於科合NY(2009)3081号作者简介：喻明成(1979-),男，本科毕业，主要从亨动物医学专业.通讯作者：汤德元(1964-),男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作.E-mail:tdy

3、uan猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(actinobaciUuspleuropneumoniae,APP)引起的高度接触性呼吸道疾病。该病主要以肺出血、坏死和纤维素性漆出为病变特征。可致各年龄段的猪发生急性和慢性感染，常与巴氏杆菌等混合感染。临床特征为：病猪发热(体温可达42C),食欲不振，呼吸困难.后期呈犬坐姿势、张口伸舌、咳喘、腹式呼吸。耳、鼻、眼及后瓶皮肽发甜.剖检可见纤维素性胸膜肺炎，尤其是肺两侧，65%的肺叶病变严重，发病率和死亡率常在20%以上，龈急性型的死亡率可高达80%100%,慢性型猪传染性膜肺

4、炎放线杆带潜伏于猪体内，可使猪只生长缓慢，平均日增敢下降，饲养报酬降低.给养猪业造成巨大的经济损失。同时，急性感染耐过或阴性感染的猪只将是带菌样,成为本病再次暴发和流行的潜在传染源，是本病防控和根除的隐患。另外，感染APP后的仔猪，由于胸椎间脓肿压迫脊髓而引起后趣麻牌。由于胸膜肺炎放线杆菌血清型较多，不同地区和猪场流行的血清型不尽相同.我国流行的优势血清型主要是1、2,3和7型。各血清型之间很少有交叉免疫保护作用，在防治本病的工作中，药物防治容易产生耐药性且成本较高，控制后极易复发.而且细菌不断产生耐药性，大魅使用抗生素还会导致药物残留.影响食品安全.因此，研制安全高效的疫苗对预防和控制该病只

5、有十分重要的意义.本文主要:针对有关猪传染性胸膜肺炎疫苗研究的进展进行综述.1灭活疫苗是猪传染性胸膜肺炎的传统疫苗，一般是用当地分离的优势流行菌株进行培养，通过加热或福尔马林处理使细菌灭活后加入适当的佐制研制而成。它的优点造安全、不存在敝毒和造成新疫源的危险，也不会返祖返强，便于贮存和运输。目前，用于预防猪传染性胸膜肺炎的商品化疫苗大多是这种疫苗。速忠新等以国内多发的APP血清1、3和7型强毒株作为制苗菌株，制成油佐剂三价天活苗。经效力试验，对上述3种血清型强毒攻击的保护率分别为88.8%.88.8%和100%,经试验动物安全性检验及田间安全检验.除个别猪出现轻微体温反应及暂时减食外，无其他异

6、常反应，表明该疫苗对猪的保护性及安全性总好.尽管灭活苗在国内运用得非常广泛，但它有许多缺点：如需多次免疫且保护效果非常有限I由于APP血清型众多，灭活苗仅能给免疫猪提供针对同一血清型菌株感染的抵抗力.甚至同型间有时也不能提供完全的交叉保护等，这些缺点给免疫预防该病带来了极大的困难。因此.研究安全、新型和能提供有效交义保护力的APP疫苗站预防和控制该病的敢要:手段.2弱毒疫苗研究表明，绝大多数APP灭活暗只能降低由于APP感染所引起的死亡率，并不能完全排除菌体以及阻止慢性感染造成的肺部损伤。研究者发现，自然感染某一血清型APP并且耐过的猪只能抵抗该血清型APP的再次感染。这就提示人们研制APP弱

7、毒疫苗来免疫猪，可能获得高效的保护。近20年来，人们对APP的弱毒疫苗进行了大量研究.取得了一定的研究进展。2.1英膜缺失弱毒疫苗Rosendal和Maclnnes(1990)将一株血清1型APP在体外传代70次，使其英膜变薄.而其他成份如外膜蛋白、全菌蛋白、Apx程素都未发生变化，结果荚膜变薄的菌株毒力减弱但仍具有一定的免疫效果.Inzana1993)用甲磺酸乙酯对APP进行诱变，得到英膜完全消失的突变菌株.该突变菌株的LPS(脂多糖)，膜蛋白以及Apx毒素都和亲本株相同.但.毒力却大为测弱。不仅如此.突变菌株免疫动物.可产生很好的保护力，用同型或异型的血清型APP对免疫动物进行攻春，均不会

8、出现临床症状。荚膜只有很弱的免疫保护性，但英膜却为APP的毒力所必需。所以英膜映失的侬株在毒力减弱的同时，并不影响其保护力.然而Inzana采用化学方法使英膜缺失的菌株存在衣型回复的可能，这是英膜缺失弱毒疫苗一个潜在的安全问题.2.2毒素缺失弱毒疫苗Bei等(2005)通过同源虱组和蔗格负向谛选系统，在血清7型APP的毒素ApxIIC基因中插入绿荧光蛋白基因(GFP)使之失活，得到了一个不含抗性基因但能表达ApxDA的突变株。突变株的毒力在小取中大为降低，免疫小鼠后能对同型攻毒提供100%的保护，对异型攻毒提供70%的保护。Xu(2006)以血清10型APP为基础，插入氯毒素抗性基因同时缺失A

9、pxlA基因编码C拂的片段，构建了能单提供潜在的交叉保护的突变株.突变株分泌大约Apxl-N端48ku的蛋白，失去了溶血活性，在小鼠中的魅力大为降低。该突变株免疫猪后.以异源血清9型APP攻毒.在临床症状、肺损伤上能提供一定的交又保护。Lin(2007)以血清1型APP分离株为亲本菌株.通过同源改组和负向筛选的方法分步缺失了Apxl和ApxII的激活因子ApxIC和ApxIIC,构建不含抗性标记的APP双基因缺失株，该突变株毒力低.免疫原性好，免疫动物可对同源血清1型APP和异源血清9型APP的攻击提供有效保护。同时，该研究还比较r鼻腔接种和肌肉注射2种免疫方式效果，结果鼻腔接种效果明显优于肌

10、肉注射免疫。2.3温度敏感型弱毒疫苗Byrd和Hooke(l997)用亚册基服诱变、育毒素和环丝紫酸寿集的方法.谛选了血清1型APP温度敏感型弱毒菌株，其生化特性、LPS(脂多糖)、外膜蛋白和Apx寿素都与亲本菌株相同，但在37C的条件下，细菌复制13代就会死亡。用温敏突变株通过鼻内免疫小敬，对5xLD,的亲本菌株攻击具有部分保护力。与先前Inzana(I993)研制的荚膜突变株比较，该突变株魅力更低，反强危险也相对较低。但是，该突变株仍然具有反强叮能，何时不能作为疫苗开发，还需要进一步改造温敏突变株，使之能稳定遗传.Byrd还评价了英膜、LPS,OMP(造骨牛奶蛋白)和毒素蛋白的抗体水平和保

11、护性之间的关系结果发现荚膜多糖和LPS的抗体水平和保护性不相关.抗体水平在不同的感染程度间没有区别，但毒素的抗体水平和保护性之间呈正相关，从而证明卷素的抗体水平在保护中起着极为重要的作用.2.4生物合成基因缺失弱毒疫苗Fuller等(1996)通过映失核黄素生物合成操纵子(ribGBAH)一部分基因后，用含有长那毒素抗性基因表达盒来取代这部分基因，利用同源重组技术获得了核黄素合成前突变株，该突变株与亲本凿株相比毒力明址降低，构建TAPP第1个编码代谢物基因映失的突变菌株.同时也是首次报道核黄素合成必需旅因缺失后能够导致病菌的卷力降低，有望把它作为弱毒疫苗候选筒株进一步研究。随后他在2000年通

12、过试验证实，将这种弱毒突变株以肌肉接种免疫动物可产生显著的免疫保护力，可以抵抗APP野毒的攻击Ingham等(2002)利用插入失活，通过氨*抗性基因表达盒的插入获得aroQ(5烯醉丙酮莽草酸-3磷酸合酶)失活的血清1型APP致弱株，由于aroQ基因映失株在体内的生存能力较差，其在动物体内的卷力也就大大降低。通过机粒互补试验可以恢复突变株在体内的生存能力，故该突变株有望发展成为一个细菌疫苗载体，表达其他猪呼吸道疾病的免疫源性基因.2.5多基因缺失弱毒疫苗随着研究的深入开展，人们对科毒疫苗的耍求也越来越高。由于APP版力因子众多，所以多个母力因子缺失的突变株/然比单幕因突变株的毒力妾降低得更多.

13、而且发生回复突变的叮能性也更小.因此.多基因突变的弱春疫苗是当前疫芯发展的方向.Oswald等(1999)发展r一种有效定点突变系统.可以把不含标记的映失璃因引入到APP中.通过这种方法，构建了源的笔因(ureC)和与帙报取相关的基因(exb)的突变株,这种方法也使在APP中构建多堆因缺央突变株成为可能。Maas等(2006)在Tonpitak(2002)构建的血清2型APP弱毒株的基础上.继续缺失了系列的魅力相关因F,包括3个与厌氧呼吸相关的酶类dmsA,hybB,aspA和铁惬取调节星因fur,得到了高度致弱的6幕因缺失株。该6幕因缺失株可以在下呼吸道克降井诱导出可检测免疫应答，免疫动物后

14、产生了对异源血清9型APP攻击的存效保护.最取要:的是，由于apxnA基因的缺央，该疫苗还可以用ApxDAELISA鉴别区分自然感染动物和疫苗免疫动物，因而可用作鉴别诊断。利用现代分子生物学技术和基因工程方法.研究不含抗生素标记基因、可以区分自然感染猪和疫苗免疫皤、低毒力或无推力的APP基因工程活疫苗菌株并研制成疫苗.是强春疫苗研究的一个发展方向.已成为目的控制猪传染性胸膜肺炎疫苗研究的热点领域。然而，对FAPP的致病机制，至今也未能得到完全阐述.所以孩得绝对低毒菌株.高效保存方法和便撞接种途径等唯趣仍然困扰样人们.由此可见APP的弱毒疫苗的研究任权而道远.3亚单位疫苗随看对APP卷力因于致病

15、性和免疫原性的研究不断深入，人们iA为全菌体灭活疫苗保护力不够是因为这种疫苗不包含APP生长过程中分泌到外界的一些推力因子，特别是Apx催素，因而开始样手研究与匪力因"相关的亚危位疫苗，以期提高疫苗的保护效粟.如用一些与致病有关的蛋白如英膜、外膜蚩白、溶血素以及多种免疫原的混合物来制备亚削位苗.研究发现将APP的2种或2种以上的僚力因*混合，如英膜多幡与脂多糖、转铁结合蛋白与脂鼓白、ApxI与ApxII、Apx】、ApxD,Apx01与OMP等进行免疫攻母保护试验均获得有效的保护。Rapp等(1986)W究畏明，用富含外膜脂阪白的制剂(OmIA)免疫动物后，对同种血清型APP的感染，

16、其有一定的保护力.Chiang等(1991)发现用蛋白W-K处理后的外膜步白免疫动物.保护效果更好.Devenish等(1990)研究发现.HOku的溶血素站一种取嘤的免疫原，刺激机体产生的抗体水平:和保护力呈正相关.其后FedorkaCray(1990)的研究发明，血清1型APP的细胞抽提物的保护力比灭活苗和外膜脂贺白的制剂更好.他推测.OmIA与细胞抽提物联合免疫动物.将会产生更好的保护力.Fedorka-Cray等1993年进-步研究细胞抽提物(主要成分为Apxl和ApxII)的保护效果.井和4种灭活疫苗免疫效果进行了对比试验，结果显示细胞抽提物可以显著降低肺部病变率和阻止死亡.认为这伸

17、细胞抽提物包含可以完全保护同型菌攻击发病和死亡的物质.Maas等(2006)发展了一种可以用于鉴别诊断的亚单-位疫苗(DIVA),它结合r先前研究的优点，在跌离子限制条件卜培养用血清I、2和5型APPapxnA缺失体.取细胞抽提物乳化，包含主要的膜茉白和分泌性蛋白.以同源血清2WAPP攻毒，免疫组没有表现胸膜肺炎临床症状，细菌分离率也显著低于对照组。以异源血清9型菌APP攻毒.免疫组肺组织没有损伤，仅有2头(共10头)猪的肺组织可分离到少缺的攻毒菌株。免疫组不产生针对ApxnA的抗体。因此，该疫苗免疫动物叮以和野卷感染动物区分.该结果表明，多种表面抗原的抗体是产生良好交义保护的原因.而单一的收

18、纽蛋白或仅含毒素加外膜带白的亚的位疫苗免疫效果很有限，无法阻止细偷定玳和肺部病灶形成。以上研究表明.Apx能素对于异源血清型APP的攻击是很成要:的-种毒力因子，但是它并不是提供免疫力唯-寿力因子，因为仅仅含有Apx卷泰的亚机位疫苗也只能提供部分保护。同时亚单位疫苗需要多次注射，通过物理和化学方法提取、纯化和制备亚敢位疫苗成本高，价格昂阪.但它的最大优点是使用时不必检测患猪的血清型，可以在全世界通用.4Ghosts疫苗灭活疫苗作为一种“死”苗，虽然具有最好的安全性.但由于在灭活过程中，某些抗原的免疫原性会遭到破坏，影响其免疫保护效果。近年来，APP的一种新的“死”苗-Ghosts疫苗的研究引起

19、很多人的兴趣。这种疫苗实际上是细菌的空壳.它是利用咚浦体0X174的E基因在苏兰氏阴性蔺(包括大肠杆惆、肺炎杆隋、盅乱弧曲、沙门氏薄、阳膜肺炎放线杆蔺)中&达后.在倘体上形或一个通道，使细简的DNA及细胞质都流失到体外，最终引起细萌的裂解失活而制备的一种疫苗.通过控制啾海体中X174的E基因&达来生产整个情体衣充，该方法制备的疫苗由F在制作过程中没有经过剧烈的物理或化学灭活过程。这些空的菌体衣充具有与活细前功能一样的抗原决定艘.从而JI备良好的免疫原性，可以诱导产生较好的免疫保护效果.Jalava等认为：Ghosts疫苗利用细胞膜定向载体，可把外源幕因定向黏附到细胞膜上，可作为

20、改组疫苗或多价疫苗的裁体.而且插入的外源蛋白抗原决定族基因不受大小的限制.Ghosts疫苗可以太姓生产.吐价格低廉.柬组体Ghosts疫苗储存方便.能K期常温保存°对实验动物进行腹腔内、皮R肌肉注射均可以激发特异的体液和细胞免疫应答|Ghosts疫苗成份，如肽聚糖也可作为天然免疫佐剂，外源配蚩白与Ghosts疫苗混合后，Ghosts疫苗的组分对靶蛋白似乎有着优于明矶和完全弗氏佐剂的佐剂效应.但是，Ghosts疫苗仍然存在灭活不伽底的缺点，需要:克服后才能在生产中应用.不同动物中的免疫分析表明，该疫苗不仅可激发体液免疫应答，还可激发细胞免疫应答。怛该疫苗作为一种“死”苗，同灭活疫苗一样

21、同样缺乏俩体在生产过程中分泌的外毒素，而外碇素在交叉免疫保护中的柬要作用已经得到证实。因此，其在交叉保护方面可能受到一定的影响.5口服疫苗目前APP的疫苗-般站采用肌肉注射的方法进行免疫。免疫接种操作困难，而且肌注普通的细函天活苗往往对注射部位造成损伤，易引起猪群紧张，伴随炎症反应、机体发热等副作用.特别是对于仔猪往往造成很大伤害。研究发现，与其他呼吸道病原菌-样，APP也是通过孙膜侵入宿七.研究表明使用口服疫苗能够诱导很高的免疫反应，当第2次免疫时加大10倍的剂鼠，动物能够克服免疫耐受.维持很高水平的全身免疫。于姑人们开始尝试开发种能i秀导帖膜免疫反应的APP口服疫苗。微胶囊技术是当今发展退

22、速、用途广泛的一种技术。它是将固体、液体或气体包裹在一个微小的胶索中，形成微胶索的物质.由于与外界环境隔离，可以免受外界环境的影响而保持俭定，在适当条件下，被包封物质又可以释放出来。Liao等(2001)利用乙基纤维素包覆技术.将天活后血清1型APP包覆于微胶囊中，将这种肠溶性微胶口服疫苗以灌杵方式接种小取，然后进行抗体椅澜，发现小肠产生了很高的黏膜IgA抗体，但与灭活苗相比，口服肠溶性微胶囊疫苗产生的IgG抗体较低.随后Liao等(2003)利用猪和小鼠对这种疫苗的保护性作了进一步研究，并与普通的全细萌天活苗进行对比.发现调整免疫剂kt和时间后，微胶囊口服疫苗所产生的菌体抗体和结膜IgA抗体

23、均比全细菌灭活苗高.而且同型APP攻毒后产生的保护也比全细菌灭活苗好。因此，不断改进的微胶囊口服疫苗有望成为一种预防猪传染性胸膜肺炎的新型疫苗酸酒醉母(saccharomycescerev-isiae)是一种优良的表达系统，和大肠杆菌相比，表达的蚩门更接近天然蚩白而保持史好的免疫活性。Y。等(2003)首先克隆了ApxDA基因并在赚酒酵母和烟竟中表达，免疫小队后能对APP的攻胜提供一定的保护力，且抗ApxDA的免疫球贺白IgA和IgG效价上升与免疫时的U服剂址呈正相关，这表明黏膜和体液免疫力可由口服疫苗诱导产生。同样，Shin等(2005)利用啤洒醉母系统表达了APPApx(IA蛋白后发展了一种口服疫苗。小鼠试验进一步证实，表达匮白具有很好免疫原性I通过检测ApxnA特异性的IgA和IgG抗体，证实了这种口服疫苗可以诱导有效的那膜和体液免疫反应.6核酸疫苗核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，是将一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，以构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统。因此，也有人称之为DNA免疫.核酸疫苗作为一种新型疫苗在结核分枝杆菌有成功试验报道.贝为成等(2005)对胸膜肺炎放线杆菌的核酸疫苗进行了初步研究.构建了ApxIIA的JX核表达质粒,可