猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展.docx

1、吱物技木通报综述与专论BIOTECHNOLOGYBVLLETIN猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展杨恒夏雪山李盛陶陈伟(昆明理工大学牛.命科学与技术学院，昆明650224)插要：猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎4(TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道疾病，可导致仔猪发生产童的呕吐、腹泻与脱水，死亡率可达100%。口腹疫苗是TGEV基因工程疫苗研允的主要方向，目前巳在踪病毒、加蔺、捋也因技物及DNA疫苗中对TGEV的S基因进行了表达，并对其口服免疫后的免疫原性进行研究。现针对TGEV基因工程疫苗近年来研究的概况进行综述，分析其优点与不足，并对其未来的发展进行展望。关键词：猪传染牲胃肠炎病毒基

2、因工程疫苗口服免疫ResearchProgressofTransmissibleGastroenteritisVirus(TGEV)GeneticEngineeringVaccineYangHengXiaXueshanLiShcngtaoChenWei(CollegeofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650224)Abstract：Porcinetransmissiblegastroenteritisisahighlycontagious,entericdiseaseofswine

3、causedbytransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV).Thediseaseisespeciallysevereinbabypigslessthantwoweeksold,characterizedbyvomiting,severediarrhe-a,andnearly100%mortality.NewdevelopmentsofTGEVgeneticengineeringvaccinehavefocusedonproductionanddeliveryoftheSproteinthroughoralimmunization.Atpresent,seve

4、ralsystemssuchasadenovirus,bacteria,transgenicplant,andDNAvaccinehavebeenusedtoexpresstheTGEVSproteins.Afteroralimmunization,theimmunogenicityofthesevaccineshasbeenstudied.TheresearchprogressofTGEVgeneticengineeringvaccinewerereviewedinthisarticle,itsadvantage,disadvantageandfurtherdevelopmentwereal

5、soprospected.Keywords:TransmissiblegaslroenteritisvirusGeneticengineeringvaccineOralimmunization收稿日期：2010-10-08基金项目：云南省自然科学基金项lj(2010ZC058)作者筒介：杨恒.男.博士.讲师.研究方向：动物传染病学与病毒分子生物学；E-mail：yaMheng2008.cool猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritisofswine,TGE)是由冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)猪传染性胃肠炎病毒(tran

6、smissiblegastroenteritisvirus,TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道疾病c该病以呕吐、严重腹泻和失水为特征，各种年龄和品种的猪均易感，尤其是两周龄以内的仔猪感染后致死率可高达100%,该病是导致世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来，随着TGEV流行危害的进一步加剧，我国各地不断有从猪场分离出该病毒的报道f2_4Jo每年冬季和早春寒冷季节TGEV常呈爆发性流行，给我国养猪业造成了严重的经济损失。在国际动物卫生法典中，猪传染性胃肠炎被列入B类传染病，是我国法定重点防控的疫病之一。1猪传染性胃肠炎病毒的致病机理TGEV无论通过口腔还是鼻腔途径感染，病毒都被吞咽

7、入消化道。在消化道中TGEV能抵抗低pH和蛋白酶水解而保持活性.直至与高度易感的小肠上皮细胞接触。病毒通过分布于小肠上皮细胞表面的氨基肽酶N(porcineaminopeptidaseN,pAPN)")和大小约200kD的黏蛋白型糖蛋白(mucin-typeglycoprotein,MGP)两种受体句，特异性侵入小肠绒毛上皮细胞并在其中大量增殖，导致上皮细胞死亡并大国脱落，小肠绒毛显著萎缩。由于小肠内的酶活性明显降低，扰乱机体正常的消化和肠上皮细胞对营养物质与电解质的运输，引起急性吸收不良综合症。同时，对于新生仔猪而言，小肠黏膜上皮细胞的损害，导致产生乳糖酶的酶类机制受阻，妨碍了糖类

8、的分解吸收，肠管内的渗透压增高，导致液体的滞留，甚至从机体组织中吸收液体，引起病猪失水、代谢性酸中毒，发生腹泻和脱水。最后，仔猪由于脱水和代谢性酸中毒以及由于高血钾而引起的心、肾功能衰竭导致死亡。2TGEV的免疫保护机制及目前主要防控措施TGEV感染后康复猪的攻毒试臆表明，肠道黏膜局部免疫应答，尤其是针对TGEV的slgA抗体可有效中和病毒从而阻止病毒对小肠绒毛上皮细胞的感染。虽然仔猪在出生后即具备产生黏膜抗体免疫应答的能力，但需较长时间才能达到成年猪抗体免疫应答的产生水平。因此，试图通过给仔猪疫苗接种，使其在出生后关键的头几天快速产生抗TGEV感染的主动免疫应答希望不大。被动免疫在保护新生仔

9、猪免受TGEV感染中起着至关重要的作用，特别是母猪乳汁中的slgA抗体可有效抵抗胃肠道中蛋白酶水解，在抗TGEV感染中起着关键作用。妊娠母猪乳腺中产生slgA抗体的浆细胞来源于肠道相关淋巴组织（GALT）,它被肠道中的抗原物质激活后进一步移行至乳腺定植，并将IgA抗体分泌至初乳和常乳中1891o因此，通过“肠-乳腺”免疫轴的激活，激发母猪乳汁中slgA抗体产生，是保护仔猪免受TGEV感染的一个主要途径。目前对TGEV感染尚无有效的治疗药物，疫苗接种仍然是该病的主要防控措施。在生产中使用最为广泛的疫苗为TGEV弱毒苗，在免疫方式上主要采取怀孕母猪的肌肉注射和口服免疫。肌肉注射虽可有效激发怀孕母猪

10、血清中IgG抗体的产生，但由于无法激活GALT,因此不能有效激发母猪乳汁中slgA抗体的产生，往往不能给仔猪提供有效的免疫保护。怀孕母猪口服弱毒疫苗免疫似乎是激发GALT的一个合理的方式，但效果尚不理想。其主要原因在于致弱后的病毒在小肠只能进行极为有限的增殖，导致对GALT中产生slgA抗体的浆细胞的抗原刺激较少，相应乳汁中IgA抗体分泌也较少。此外，在使用弱毒疫苗时，另一个值得注意的问题是弱毒疫苗存在毒力返强和散毒的潜在危险。基于上述问题，进一步研究简便、安全、能有效激活GALT的TGEV基因工程疫苗仍然十分必要。3猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究TGEV可编码3种主要结构蛋白：纤突蛋白（

11、S蛋白）、膜内在（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。S蛋白为高度糖基化蛋白，突出于病毒粒子囊膜表面，其上含有宿主细胞氨肽酶N（pAPN）的识别位点，在病毒感染、发挥致病性和决定宿主细胞亲嗜性等方面起关键作用【'°-。S蛋白的N端包含了A、B、C和D4个主要的B淋巴细胞抗原决定位点，是诱导机体产生TGEV中和抗体的主要区域UJ5o研究表明，S蛋白N端可激发与全长S蛋户|相当的中和抗体的产生"6）。在TGEV的3个主要结构蛋白中，S蛋白是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白，因此S基因成为TGEV基因工程疫苗研究的首选抗原基因。同时，为有效激发肠道黏膜免疫应答，

12、口服疫苗成为TGEV基因工程疫苗研究的重点。因此，目前已在多种不同的载体系统中对全长或截短的S蛋白进行了表达，并对其口服免疫后的免疫原性进行了研究。3.1以病毒为载体表达S蛋白腺病毒易于培养纯化，病毒产址高，在腺病毒基因组中特定区域内插入外源DNA,不影响病毒增殖，而且还能使外源基因良好表达。口服重组腺病毒后，可诱导较强的系统免疫反应与局部的黏膜免疫应答。因此，腺病毒较早作为TGEV口服基因工程疫苗的活载体。Torress等如用人腺病毒5（AD5）为载体，构建了系列表达S基因不同片段的更组腺病毒，将表达A-D4个主要抗原位点的重蛆朕病毒通过口鼻和腹膜途径接种猪，可诱发猪血清中TGEV中和抗体的

13、产生。将免疫后的猪血清与致死剂质的TGEV混合后口服接神乳猪，可被动地减少仔猪的腹泻和死亡，但不能抵抗TGEV的感染。这说明重组腺病毒口鼻和腹膜途径接种猪后产生的抗体效价不高，不能完全中和病毒。由于采用人腺病毒作为动物病毒载体存在安全问题，因此Tuboly等回采用猪腺病毒（PAdV-5）分别构建了表达全KS基因和S基因5'端约2.2kb的重组猪腺病毒，从中筛选出3个重蛆腺病毒经口接种易感猪。结果表明,重绢腺病毒同时诱发了针对TGEV和PAdV-5的特异性血清IgG抗体，且在免疫猪的小肠和肺脏中检测到TGEV分泌型IgA抗体，但用TGEV对接种猪进行攻毒，其结果如何有待进一步研究。3.2

14、 以细菌为载体表达S蛋白随着以肠道细菌为活载体传递抗原进而激发肠道粘膜免疫这一技术路线的提出，研究者也试图在肠道菌中表达TGEV的S蛋白，进行重组活菌的口服免疫。目前研究主要集中在减毒沙门氏菌、乳酸杆菌等肠道曲上。与活病毒载体疫苗相比，其优势在于细菌培养操作简单，成本低廉。Smerdou等将编码TGEVS$白氨基端、按基端、中间段以及全长S蛋白的4个基因片段分别插入原核表达质粒pYA292(asd+)中,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌乂3987(asd-、cya-和crp-)中进行表达。结果表明，编码S蛋白氨基端与全长S贺白的基因片段能在沙门氏菌中稳定表达，且两种重组菌在体外连续繁殖50代后仍有60

15、%和20%的重组菌能持续表达S蛋白氨基端与全长S蛋白。将表达S蛋白氨基端的重组沙门氏菌口服免疫猪后，细菌在空肠中定植的时间长达10-20d,在猪的血液和唾液中均检测到TCEV特异抗体。Smerdou等)还将不同拷贝数的S蛋白D抗原位点与大肠杆菌热不稳定B毒素亚基在减毒鼠伤寒沙门氏菌X3987中进行了融合表达，将重组菌口服免疫家兔后可诱导血清中TGEVIgG抗体和肠道黏膜中TGEVslgA抗体的产生，但在小肠中sl-gA抗体滴度较低。除在沙门氏菌的胞质中进行TGEVS蛋白的表达外，研究者也在沙门氏菌的菌毛上对S蛋闩的抗原位点进行表达mm。其优势在于表达的抗原蛋白直接位于细菌的表面.能更好地刺激免

16、疫应答。但由于是将抗原位点嵌合在菌毛中表达，因此只能表达很短的一段抗原肽，这极大地限制了特性抗体应答的强度。H。等*:在乳酸杆菌中成功进行了TGEVS蛋白N端约75kD的重组蛋白的分泌表达。将重组萌口服免疫小敏后，可检测到接种的小鼠产生了针对TGEV的特异性血清IgG和IgA,诱导的抗体具有一定的TGEV中和活性。唐丽杰等网也报道，将表达TGEVS蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫可激发肠道黏膜产生抗TGEVIgA抗体c转基因植物表达S蛋白近年来，植物基因工程技术的迅速发展，将病原微生物的抗原基因在农作物中进行表达，研制可食疫苗成为当前植物基因工程研究的一个重要方向。在转基因农作物中表达抗原蛋白进行

17、口服免疫具有成本低廉、免疫途径简单，疫苗存储无需冷藏设备，可大范围给药等优点勺。Comez等】将分别编码TGEVS蛋白氨基端与完整S蛋白的基因片段与花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子组成表达盒，通过基因重组将表达盒整合入拟南芥植物基因组中。结果表明，整合入植物基因组中的S蛋白得以表达。从转基因拟南芥叶子中提取的重组蛋白免疫小融后可激发血清中TGEV抗体的产生，且抗体具有一定的中和活性。Gomez等又在转基因马铃磬表达了TGEVS蛋白的氨基端区域(N-gS),将从马铃薯块茎中提取出的重组N-gS蛋白通过腹膜内途经免疫小鼠，接种的小鼠产生了针对TGEV的特异性血清IgG,而且用表达N-gS的马铃

18、薯块茎直接饲喂小鼠时，小鼠也产生了针对S糖蛋白特异性血清抗体。Lamphear等皿构建了表达S基因的转基因玉米，用该转基因玉米种籽饲喂母猪，母猪血清、初乳和常乳中均检测到TGEV抗体的产生。3.3 S基因DNA疫苗研究DNA疫苗免疫后能有效激发细胞免疫与体液免疫，具有安全可靠、便于多价苗和多联苗研制、制备工艺简单及存储运输方便等优点，已广泛应用于多种疫病的疫苗研究中，并取得良好的试验效果月前，对于TGEVS基因的DNA疫苗，已进行了初步的研究。任晓峰等以真核表达质粒pCI为载体，构建了含S基因主要抗原位点的DNA疫苗，肌肉注射免疫小鼠后可诱导小鼠血清中特异性TGEVIgG抗体的产生，显示了良好

19、的免疫原性。近年来，以减毒细菌为载体携带DNA疫苗进行口服免疫被证实是激发黏膜免疫的一种理想途径:本研究构建了含S基因主要抗原位点的真核表达质粒PVAX-S,进一步将其转化入减毒沙门氏菌SL7207中，构建了携带TGEVS基因DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX-S)o将重组沙门氏菌口服免疫小鼠后.结果表明，除可有效激发免疫小鼠血清中特异性TGEVIgG抗体的产生，也可有效激发免疫小鼠肠道中slgA抗体的产生4问题与展望尽管目前在TGEV基因工程疫苗研究上取得了可喜的成果，但上述几种形式的TGEV基因工程仍存在-些不足。以腺病毒作为载体，一方面其外源基因容量较小难以克隆大片段或多个外

20、源基因的表达；另一方面由于表达蛋白大小受限，导致机体免疫系统对腺病毒大蛋白的强烈应答，可能消弱外源蛋白诱导的免疫应答反应七在肠道细菌中表达抗原蛋白其缺陷在于细菌中表达的抗原蛋白无法进行正确的翻译后修饰与慵基化，这极大地影响表达贺白的免疫原性；同时，重蛆细菌在体内存活时间，赍白在细菌中的表达最、稳定性等问题也仍需进一步研究与完善'侦。转基因植物疫苗目前尚待解决的问题主要有两个：一是转基因植物中抗原蛋向表达量:普遍较低，限制了食入转基因植物后激发的免疫应答强度；二是转基因植物中的抗原蛋白在通过胃肠道时容易受到降解而丧失其免疫原性以减毒沙门氏菌携带DNA疫苗曰服免疫，存在免疫后机体内细菌携带

21、的高拷贝质粒迅速丢失的情况，同时针对沙门氏菌载体的免疫应答将消弱其传递的DNA疫苗免疫效果叫。综上，在TGEV口服基因工程疫苗的研究中，目前选用的载体系统各有优缺点，但尚没有合适的载体系统能同时满足以下3点：（1）S蛋白能大址的表达；（2）表达的S蛋白能有效进行翻译后修饰、折叠；（3）有效避开胃肠道对表达的S蛋白的消化降解。冠状病毒是自然界最大的单股正链RNA病毒，对TGEV全长cDNA克隆的拯救成功，是RNA病毒反向遗传研究的一个重要突破。Almazan等叫在TGEV的感染性cDNA克隆的基础上进行了基因置换，将来源于呼吸道嗜性的弱毒株基因组全长cDNA克隆中的S基因替换为具有肠嗜性强毒株的

22、S基因，结果所拯救的病毒是具有肠嗜性的强毒株，这表明可通过反向遗传技术来改变TGEV的组织嗜性和毒力。Izeta等顺将创造一个来自TGEV和呼吸道毒株嵌合的病卷用于表达S蛋白，如果能把它充分致弱，这种嵌合病毒有望成为候选TGEV疫苗C参考文献I 斯待劳BE.主编.赵德明.张中秋，沈建忠，洋.猪病学(第8版)M.北京：中国农业大学出版社,2000:306-338.2j陈焕春，刘超,金梅林.等.猪传染性当肠炎病健的分岛鉴定.华中农业大学学报.1992.1(11):82-86.3 任晓岭,李一经，贾永清，等.猪传染性肖肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外株的同源性比较.中国兽医科技,2002.32(

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