用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究.docx

1、用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究戴志红，蒋卉，李翠，王晓卉，张秀英，王在时*(中国兽医药品监察所.北京100081)收稿日期2013-09-05文献标识码A文章编号1002-1280(2014)01-0034-04中图分类号S852.651摘要为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力，以猪瘟病毒抗体(兔源)为一抗、荧光素标记羊抗兔IgC为二抗，建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法(IFA)。特异性试验表明，用该IFA方法检刑CSFV兔化弱毒株接神的RK绍胞为阳性，而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。CSFV兔化弱毒株和

2、活疫苗的兔体感染量(RID)用兔体测定，半数组织感染量(TCIDjo)用IFA测定，拟合R1D与TCI%的线性回归方程，确定1RID/mL=(TCID/O.hnL+200)/12o关键词猪瘟疫苗；效力；兔体感染量；间接免疫荧光UsinganIndirectImmunofluorescenceAssayforEvaluatingtheEfficacyofLiveClassicalSwineFeverVirusVaccine(CStrain)DAIZhi-hong,JIANGHui,LICui,WANGXiao-hui,ZHANGXiu-ying,WANGZai-shi,(ChinaInstili

3、UeofVeterinaryDrugControl,Beijing100081.China)Abstract:UsingtheantilxxlyagainstCSFV(Cstrain)astheprimaryantilxxlyandtheF1TClabeledgoatanti-rabbitIgGasthesecondantibody,anindirectimmunofluorescenceassaywasdevelopedtoevaluatetheefficacyofliveclassicalswinefevervirusvaccine(Cstrain).TheIFAshowedpositiv

4、eresultindetectionRKcellsinoculatedwithCSFV(Cstrain),butnegativeresultsindetectionRKcellsinoculatedwithpseudorabiesvirus,porcineparvovirusand资金项目：农业部2012年引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目“兽药监管技术引进”(2013G14)；农业部农产品质虽安全监管专项“兽药及兽药残留检测标准物质研制与制备"(2130109)作者简介：戴志红，博士,副研究员，从事兽药标准物质及分子病毒学研究。通讯作者：王在时。E-mail：wangz

5、aishi参考文献：I高中.现代约物新刑型新技术M.北京:人民军医出版社,2002.229-252.：2汤丽始,候新朴.乳剂递药系统J.国外医学-合成药、生化药、制剂分册.1988.9(5):2-296.3 梁治齐，宗惠始，李金华.功能性表面活性剂M.北京:中国轻工业出版社，2002.113-130.4 王文涛，王建刚，赵庆帽,等.D相乳化法微乳液的制备及物理模拟应用J.精细石油化工，2003.5：11-13.5 梁文平.乳状液科学于技术基础M.北京:科学出版社,2001.246-248.6J王明俊.冉医生物制品学M.北京:中国农业出版社，1997,152.7魏蔡贤，钟芳,麻建国.亲脂性乳化剂

6、的性质和用依对W/0/W票夏合乳状液稳定性的影响J.食品与生物技术学报，2007,26(4) ：16-21.8严布志.钟掘.乳液稳定性与其相关因素的关系UJ.合成润滑材料，1997.2：11-13.9陈优生.张健泓.乳剂物理稳定性的研究J.海峡药学.2008.20(6) ：19-22.(编辑:陈希)bovineviraldiarrhea-mucosalvirus.Rabbitinfectiondose(RID)testedwithrabbitsand50%tissuecultureinfectivedose(TCIDjq)testedwithIFAinCSFV(Cstrain)andvacci

7、newerelx)thcarriedout.ThelinearregressionequationfittingtheTCIDoverRIDwasconducted,andtheresultisthatlRID/mL=(TCIDjq/O.lniL+200)/12.Keywords:classicalswinefevervaccine；efficacy；rabbitinfectiondose；indirectimmunofluorescenceassay猪瘟（ClassicalSwineFever,CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病,在许多国家和地区均有发生n

8、F,给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将CSF列为法定通报性疫病，我国将其划为一类动物传染病。我国从20世纪50年代开始研究和推广CSF兔化弱毒疫苗，为世界上许多国家CSF的控制和消灭做出了重要贡献。到目前为止,CSF兔化弱毒活疫苗免疫仍是世界上广为采用的最有效、经济的CSF控制方法，而我国正在实行CSF强制免疫计划。效力检验是保证疫苗质量的关键环节之一，根据相关规定,CSF兔化弱毒活疫苗的效力检验可采用家兔或猪进行，但用猪进行效力检验成本高、周期长，故在生产实际中，多采用家兔体温反应法。然而，家兔体温反应法易受家兔品种、个体及环境等因素影响，且仅用2只家兔判定结果不

9、符合统计学要求，因此存在一定局限性。本研究通过建立间接免疫荧光检测方法（Indirectimmunofluorescenceassay,IFA）测定CSFV兔化弱毒株和活疫苗.的半数组织感染量（TC1D知），并探索TCID与家兔体感染量（Rabbitinfectiondose,RID）之间的数屈关系，以期建立体外效力检验方法。1材料与方法病毒株和细胞CSFV兔化弱毒株（F480）、牛病毒性腹泻/粘膜病毒（BVDV）Oregon株、猪细小病毒（PPV）7909株、伪狂犬病毒（PRV）Batha株、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）JXAl-R株、RK细胞由中国兽医药品监察所鉴定、保存。1.1

10、主要试剂和耗材CSFV抗体（兔源）系家兔反复免疫CSFV兔化弱毒株后采血分离血清获得,羊抗兔荧光抗体（F0382）购自Sigma公司；CSF兔化弱毒活疫苗（兔源,2012077）购自福州大北农生物技术有限公司，CSF兔化弱毒活疫苗（淋脾源,2012031）由成都天邦生物制品有限公司提供,CSF兔化弱毒活疫苗（细胞源J39128）由南京天邦生物科技有限公司提供;96孔细胞培养板购自Costai公司，DMEM液体培养基、胎牛血清购自Gibco公司。1-3实验动物清洁级1.53kg口本大耳白兔购自北京维通利华实验动物技术有限公司。1.4 CSF兔化弱毒的RID测定将CSFV兔化弱毒株种毒或CSF兔化

11、弱毒活疫苗复溶后分别用生理盐水作1：150750倍稀释，每个稀释度注射2只家兔，同时设立生理盐水阴性对照和50倍稀释的种毒阳性对照，按文献6中的体温反应标准判定结果，以能引起体温反应的最大稀释度作为该种毒或疫苗的RID。1.5 CSF兔化弱毒的间接免疫荧光检测方法方法建立分别取1RID/mLJORID/mL、100RID/mL的CSFV兔化弱毒株种毒和CSF兔化弱毒活疫苗分别接种长有RK细胞单层的96孔细胞培养板,每样接种8孔,每孔接种0.1mL,同时设正常细胞对照。培养72h后弃去培养液，用PBS洗涤23次,每孔加0.1mL预冷细胞固定液（50%丙酮+50%甲醇），置于28弋固定30min（

12、或置于-20弋过夜）。弃去固定液，用PBS洗涤23次，每孔加1：200稀释的CSFV抗体（兔源）0.1mL,置于37无孵育45min。弃去一抗，用PBS洗涤23次,每孔加1：200稀释的羊抗兔荧光抗体0.1mL,置于372孵育45mino弃去二抗，用PBS洗涤23次,荧光显微镜观察结果，以可见特异性亮绿色荧光判定为阳性。1.5.1 方法特异性将病毒含量大于10'TCID知/0.1mL的伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒病（PPV）、牛病毒性腹泻/粘膜病毒（BVDV）按1.5.1项方法进行免疫荧光检测CCSF兔化弱毒的TCIDjo测定将已测定RID的CSFV兔化弱毒株种毒和CSF兔化弱毒活

13、疫苗分别用无血清DMEM稀释至150-750RID/mL,再分别作10系列稀释，按1.5.1项方法进行免疫荧光检测，按Karber法计算TCID%。1.7TCIDm与RID的数量关系将CSFV兔化弱毒株种毒和疫苗各稀释度RID与测得的相应，亿心如数据拟合线性回归方程，即为TCIDm与RID的数世关系。2结果2.1CSF兔化弱毒的间接免疫荧光染色不同病毒含ht的CSEV兔化弱毒株种毒和CSF兔化弱毒活疫苗接种RK细胞后均出现明显的亮绿色荧光,荧光强度和面积随接种病卷含M增加而递增，而正常细胞对照不出现该荧光；相同病毒含量的各种CSF兔化弱毒活疫苗和CSFV兔化弱毒株种毒接种后产生的荧光无明显差异

14、（图1）。BVDV、PPV、PRV接种RK细胞后均不出现荧光。2.2 不同R【D种毒和活疫苗的TCIDiH定结果先测定CSFV兔化弱成株种毒和CSF兔化弱谁活疫苗的RID,再分别稀释至150-750RID/mL,用间接免疫荧光方法测定各自TCID炉结果见表10TCIIM与RID的数量关系将TCID/O.lmL与相应的RID数据拟合线性回归方程，结果RJ0.979,线性关系良好，其数ht关系为y=11.978x-221.62,即lRID/mL=（TCID/0.lmL+221.62）/11.978O为便于计算，可修正为IRID/mL=（TCIDjo/O.1mL+200）/12。A-I）：CSFV兔

15、化弱毒株种推接种RK细胞（IJOJOORID/ml.和阴性对照）；E-H-CSF兔化弱毒活疫苗（兔源）接种RK细胞（l、IO、IOORID/ml.和阴性对照）；II-：CSF兔化弱毒活疫苗（细胞源）接种RK细胞（IJOJOOKII）/mL和阴性对照）图1CSFV兔化弱毒株种毒和活疫苗的间接免疫荧光染色（200x）表1不同兔体感染量（RID/mL）的种毒和疫苗测得的半数组织感染量（TCID/O.lmL）兔体感染址（RID/mL）样品150300450600750Em顷lo'lo4lo-vlo-'lo51?5"二3.«|ooooO二二Mlo-'lo-&#

16、39;loelo3.S.75.25375.4710-10J105103-105.253.5I2S.25.2Slo-'lo5%!©5种毒(F480)兔源(2012077)淋脾源(2012031)细胞源(139128)XRID/mL图2RID与对应TCID如值拟合线性回归3讨论与小结在正常情况卜LCSFV感染细胞后不产生细胞病变，因此CSFV的分离、鉴定、毒价测定常用免疫荧光检测方法进行，但CSF兔化弱毒一直难以用FA或IFA进行检测。由于CSF兔化弱毒在兔体传代致弱过程中产生了引起家兔特异性体温反应的能力，因此,CSF兔化弱毒的病毒含量可以采用兔体测定RID方法进行,但该方法一

17、直存在检测周期长、成本高以及结果易受家兔品种、个体及环境等因素影响等缺点，在生产实际中严重影响了CSF兔化弱毒活疫苗的效力检验。实时荧光定量PCR方法是前一阶段兴起的一种快速、敏感、特异的检测方法，有学者将其用于CSF兔化弱毒活疫苗的病毒含量:测定，但仍然存在受RNA提取率、反转录效率影响和不能区分活病毒与失活病毒等严重缺陷。为此,CSF兔化弱毒活疫苗效力的其他体外检测方法研究仍十分必要。本研究采用CSF兔化弱毒反复免疫家兔制备的抗体作为一抗，成功建立了IFA,可能的原因是采用该方法制备抗体提高了抗体与病毒的亲和力。通过该1FA方法发现,CSF兔化弱毒免疫荧光在细胞内呈点状分布，而CSFV其他

18、毒株的免疫荧光均匀分布于细胞浆。这是否由于某种致弱机制影响了病毒粒子从内质网或高尔基体等细胞器的释放，值得进一步研究。另外，本研究采用RK细胞作为接种细胞，缩小了细胞的感染潜，有效避免了其他外源病毒尤其是BVDV的干扰，取得了较好的特异性。与RID检测方法相比,1FA具有快速、特异、稳定等优点，因此可望作为CSF兔化弱毒活疫苗检测的体外替代方法。参考文献：1EdwardsS,FukushoA,LeftvrePC,etal.Classicalswinefever：theglobalsituationJ：.VetMicrobiol.2000,73(2/3):103-119.L2DomenechJ,IuhrolhJ,EddiC,rtal.RegionalandinternationalapproachesonpreventionandcontrolofanimaltransItoundaryandemergingdiseasesJ'.AnnNYAcadSci,2006,1081:90-107.3'http：/www.oie.inl/eng/nialadics/en_classincalion20l0.him?eld7