百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究.docx

1、.论著.百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究李鑫，高晶晶，罗树权，李燕婷，乔瑞洁，刘方蕾，谢贵林兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心，11.甫兰州730046摘要：目的提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂真糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物，并分析其理化性质及免疫原性。方法通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用曲解法纯化LOS,通过1%冰醋酸水解获得寡(oligosaccharides,OS),产物经Tricine-SDS-PA(；E及核磁共振级i普(HNMR)鉴定。OS的羟基经1

2、-氤基4二甲氛基n比嚏四氯硼酸酯(1-cyano-4-(limethylaminopyridiniumtetrafluoroljorate,CDAP)活化后，与破伤风类毒素己二酸酰麟衍生物(1TAI1)共价结合,制备多糖蛋白结合物.经SephacrylS-300层析柱纯化后收集结合物原液.并对结合物的理化性质、抗原性进行分析，采用两种剂量(2.5pig/剂和5.0ng/剂)免疫BALB/c小鼠，分析其免疫原性。结果纯化后LOS纯度>90%,核磁共振结果表明OS结构正确,功能基团得到保留。制备的结合物抗原性未发生改变，经3针免疫后，两种剂量下结合物均有剂次加强效应(P<0.05),旦

3、两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论将百日咳杆菌OS与TIh结合是制备百门咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径，并旦结合物在小鼠体内其有良好的免疫应答。关键词:百日咳鲍待菌;脂寡糖;结合物;免疫原性中图分类号：R37842文献标志码：A文章编号：1005-5673(2018)05-0021-07DOI：10.133O9/ki.Pmi.2O18.O5.OO4Preparationoflipo-oligosaccharidesfromBordetellapertussisandinvestigationofrelatedconjugateimmunogenicityinmiceLIXin,

4、GAOJing-jingtLUOShu-quan,LIYan-ting,QIAORui-jie,UUFang-lei,XIEGui-linTheb'irstResearchDepartment,LanzhouInstiluleofBiologicalProductsCo.Jid.,CenterforG<insuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,(kinsuProvince,ChinaCorrespondingauthor：XIEGui-lintE-mail:glxieAbstract:ObjectiveTopur

5、ifylipo-oligosaccharides(LOS)fromBordetellatertussisandpreparationoftherelatedconjugates,andtoinvestigatethephysicalandchemicalpropertiesandimmunogenicityoftheconjugatesinmice.MethodsThelipo-oligosaccharideswereextractedfromBordetellapertussiswithmodifiedhotphenolwatermethod,andpurifiedbyenzymatichy

6、drolysis,oligosaccharide(O-SP)wasobtainedby1%glacialaceticacidhydrolysis,andtheproductwasidentifiedbyTricine-SDS-PAGEandNMR(1HNMR).Thehydroxy)ofhydrolysatewasactivatedby1-Cyano-4-dimclhylaminopyridiniumtetrafluoroborate(CDAP)andthencombinedwithTPAI)inpreparationoftheconjugate.Theconjugateswerepurifi

7、edbySephacrylS-300chromatography.Thephysicalandchemicalcharacteristicsandantigenicityoftheconjugatewereanalyzed.Balb/Cmicewereimmunizedwithtwodoses(2.5pig/dogeand5p.g/doge)oftheconjugatesandtheimmunogenicitywasanalyzed.ResultsThepurityofoligosaccharideswasmorethan90%.TheNMRresultsshowedthatthestruct

8、ureofoligosaccharideswascorrectandfunctionalgroupswereretained.Theantigenicityofthepreparedconjugatesdidnotchange.Therewereboostresponsesbythethreeconjugateimmunizationswithtwodoses(P<0.05),andtherewasnoastatisticaldifferencel)etweenthetwodoses.ConclusionItwasafeasiblewayinpreparationofconjugatev

9、accineagainstBordetellapertussisinfectionbycovalentlinkagebetweenLOSandcarrierproteinsofTTH.andthepreparedconjugatescouldgeneratehighlyimmuneresponsesinmice.Keywords：Bordetellapertussis;Lipo-oligosaccharides(LOS);Conjugate;Immunogenicity作者简介：李燕(1992-),男，硕士研究生，主要从事细通性疫百日咳(pertussis)是一种由百日咳鲍特菌(Bor-苗研究

10、。detellaPer岫is,简称百日咳杆菌)引起的急性呼吸通信作者：谢资林，研究员，E-mail:«lxie道传染病，百日咳杆菌以人为唯一天然宿主，虽然有良好的疫苗接种覆盖率，但每年仍有5000万例患者并导致约30万例患者死亡,90%的病例发生于发展中国家。目前，有两种百日咳疫苗，一种为全细胞白日咳疫苗(wholecellpertuussisvaccine,wP)，另-种为无细胞百日咳疫苗(acellularpertussisvaccine,aP)owP从20世纪40年代就开始使用,有效降低了百日咳的发病率和死亡率，但该疫苗副反应发生率高，且症状严重。经过数十年的努力，一种更安全的

11、aP被研制出来，并从20世纪90年代逐步替代wP。但近年来，在疫苗接种覆盖率很高的地区，百日咳疾病出现了明显的反弹。2010年美国加州的百日咳病例超过9000例,创其近60年的峰值。2012年英国百日咳的死亡率达到自1984年来的最高位知。WARFEL等在狒狒模型中证明,aP虽然可以对鲍特菌感染提供保护，但不能完全阻止其传播，且aP预防感染的效果明显不如wPo百日咳疾病的复燃需要重新去认识百日咳疫苗，其中，添加可诱导杀菌活性的抗原也不失为一种可行的思路，针对细菌扯外层多糖抗原的抗体都具有杀菌活性俭o百日咳杆菌的外围多糖是脂寡M(lipo-oligosaccharides,LOS)0相对于脂多W

12、(lipopolysaccharide,LPS)的多檀重复结构，LOS只有与核心宾oligosaccharides,OS)相连的末端三糖，故JE相对分子质量更小。百日咳杆菌LOS的末端多糖是一种非重复的三糖结构，分别为a-N-乙酰氛基葡萄糖J3-2-乙酰基基-3-乙酰氨基-2,3-双脱氧-甘露糖酵酸和F-2.乙酰氨基-4-甲基基-海藻糖，见图1。由于LOS抗原属于胸腺非依赖型抗原，其免疫原性弱造成抗体持续时间短，一般不能诱导免疫记忆炒此。所以本研究将百日咳杆曲OS与破伤风类毒素衍生物(tetanustoxoidderivatives,TTAII)结合,制备成百日咳杆菌多糖蛋白结合物，并对其结合

13、工艺及免疫原性进行研究。a-GIcNI7a-GleA-2-a-HeplP13(«-GlcNAcl-/?-ManNAc3NAcA-3-/?-FucNAc4NMe)K-(>-aGlcNl-/-Glc-4-a-Hep-5-a-Kdo-lP-2-(>-LipidA|4ma-Hpea-GalNA图1百日咳杆菌LOS的结构Fig.lStructureofpertussislipo-oligosaccharides1材料与方法1.1蔺种百日咳杆菌58031株由兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室提供。1.2载体及超免血清1将、白日咳杆前家兔免疫血清、破伤风类毒素小鼠免疫血清均由兰州

14、生物制品研究所有限责任公司提供。1.3实验动物SPF级BALB/c雌性小鼠，体重1214g,由兰州生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供。14主要试剂及仪器氢氧化钠、冰醋酸、氯化钠、硫酸、氯化钙和醋酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；碱性磷酸前标记羊抗鼠1如购自Soulhembiotech公司；己二酸二酰麟(ADH)、1.氤基4二甲胺基毗陇四瓶硼酸盐(1-cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)、三乙胺(TEA)、脱氧胆酸钠(DOC)、乙睛、苯酚、DNaseI、RNaseA和ProteinaseK均购自Sigma公司。Sep

15、hacrylS-300层析柱、凝胶层析系统均购自GE公司；Bio-gelP-4层析柱购自美国Bio-Rad公司;600MHz核磁共振谱仪购自Broker公司;SpectraMAX190酶标仪、96孔酶标板均购自Costar公司；透析袋购自Millipore公司。1.5 OS的制备及鉴定LOS的提取及纯化称取200g菌体，采用改良热酚水法提取LOS,通过酶解法纯化提取物。将粗制LOS用200mL2mmol/LMgSO4-50mmol/LTris(pH7.6)缓冲液溶解后装入透析袋，加入DNaseI300mg%RNaseA150mg,37弋搅拌透析68h。加入ProteinaseK200mg,37

16、T搅拌透析1214ho将透析物移入28用无热原蒸憎水搅拌透析2d以上，每天换水两次。以离心半径8cm,8000r/min4Y离心40min,弃沉淀，收集上清。上清冻干后得精制LOS.-20Y冻存待用。以wrry法测定蛋白含址，全波长扫描测定核酸含最，用Tricine-SDS-PAGE电泳分析纯度，用免疫双扩散法测定抗原性。1.5.1 LOS水解制备OS将粘制LOS用注射用水溶解成10mg/mL,加入冰醋酸至终质堡分数为1%,100%：油浴90min,将pH调整至7.0左右终止反应。以离心半径8cm,35000r/min,4丁超速离心4h,取上清，上清冻干。用毗噬：醋酸：水缓冲液（体积比为4：8

17、：988,pH4.7）将冻干物溶解成20mg/m"使用Bio-gelP-4层析柱，缓冲液同为毗陇醋酸溶液，流速1mVmin,将第一峰合并装入透析袋，用注射用水48幻透析2d,每12h换水1次。冻干后称重，于-20无保存。1.5.2 OS的结构分析通过核磁共振分析组谱'HNMR分析OS的结构。1.6 结合物的制备将OS用0.85%NaCl溶解成20mg/mL,室温静置过夜。测初始pH,室0.1mol/LNaOH溶液调整pH至5.86.2。CDAP以100mg/mL溶于乙脂中,向溶液中加入OS一半质量的CDAP,维持pH5.8-6.0反应30s,用TEA溶液将pH维持在7.3,反

18、应2min。加入TT.m,维持pH7.88.2之间反应2婚反应液装入MWCO10000透析袋，用0.85%NaCl溶液透析2d。间隔8h置换透析液1次。将透析后的反应液经0.2pirn滤器过滤后，用SephacrylS-300层析柱纯化，收集、W0.25的洗脱液,流动相为0.2mol/LNaCl溶液。将收集的洗脱液经0.22jim膜除幽过滤，收集滤过液，即结合物。1.7结合物检测1.7.1结合物的理化性质多糖采用苯酚-硫酸法测定，蛋白质采用Lowry法测定。取1ml,结合物原液，加入1%脱氧胆酸钠（pH7.3）100pL,充分混匀,4勾放置30min,加入50皿的1mol/LHC1,以离心半径

19、8cm,12000r/min离心30min,缓慢吸取上清1mL0测定上清中多糖含房，换算游离多糖含量。1.7.2结合物鉴别试验采用琼脂糖免疫双扩散法对结合物进行鉴别试验，方法参照中华人民共和国药典2015版（三部）“免疫双扩散法”执行。1.7.3抗原性检测采用抑制EL1SA对OS和结合物的抗原性变化进行检测。百日咳杆菌LOS以10pg/mL包被于Costar酶标板，每孔100|xL,4气:放置过夜;将不同质最浓度的待测样品溶液（OS或结合物）60nL加入60nL稀释后的兔抗全菌体超免血清中，每个样品浓度平行两孔,充分混合形成抗原-抗血清混合液，室温放置30min后，100头1/孔加入酶标板,3

20、7丁孵育2h；洗板5次,拍干；100|iL/孔加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗,37丁孵育2h；洗板5次，拍干；在酶标板中海孔加入100碱性磷酸醐底物,37弋放置1h；读取AnmO以未吸附的超免血清为阳性对照，未加血清的Ifll清稀释液为阴性对照，吸附的血清为样品，阳性孔的4值应在1.52.0之间，按如下公式计算抑制率:抑制率=1-（孔性-4怵/侦性-4阴性）乂100%,将多糖浓度和相应浓度下的抑制率输入Graph-Padprism软件，绘制抑制曲线。1.8结合物免疫原性1.8.1免疫接种及采血将小鼠随机分为3组（OS组、结合物组一、结合物组二），每组20只，免疫剂量分别为2.5、2.

21、5、5.0jig/只,于0、14、28d经腹股沟皮下注射0.1mL。注射后28d、42d小鼠眼球采血.分离血清。1.8.2抗体水平检测用间接ELISA测定血清抗LOSIgG含量。百咳杆菌LOS以10|ig/mL包被于96孔槌标板，100闫/孔,4乞放置过夜；洗板5次,拍干；血清稀释（第2针血清200倍稀释，第3针血清500倍稀释，阴性血清20倍稀释。小鼠ELISA参比血清500倍稀释备用）。向第-排每孔中加入200|iL血清后，依次2倍系列稀释,37Y放宜2h,洗板5次;每孔加入100jiL碱性磷酸前标记羊抗鼠lgG37Y孵育2h,洗板5次;在酶标板中每孔加入100piL碱性磷酸酶底物，37龙

22、放置1h；读取力蜘5。采用Softmax软件分析中提供的四参数拟合法分析数据，阳性血清ELISA单位为100EU/mL,应用分析模板对各样品的IgG含量:进行计算。1.8.3统计学方法采用SPSS22.0软件进行统汁学分析，免疫原性的比较采用单因素方差分析，以尹0.05为差异有统计学意义。2结果OS的制备及婆定2.1.1 LOS的Tricine-SDS-PAGE结果百日咳杆菌LOS的Tricine-SDS-PAGE结果显示有2个条带，迁移慢（BandA）的是完整的LOS,含有类脂A、核心OS和末端三糖;迁移快（BandB）的仅含有类脂A和核心OS。经过酶解处理后LOS（泳道2）纯度大于90%,

23、未出现杂蛋门条带，相对分子质量在4000左右，见图2。注:泳道I.出时低分fMiMarler；泳道2.U>S图2百日咳Hl%LOS的Tricine-SDS-PAGE银染图注:中间孔.输耗的4日北肝倘免疫it清；孔I.U>SJL2.OS图3U)S及OS琼脂物免疫双扩散Fig.3Testli|x>-olig<>siiri-l)ari(leand<>lig<»«i<-<-hari<l«*l>agan»wdoulilciiiiiimiKKlifTiisionFig.2llicsilivrrs

24、tuiningofR./M-rtuxsisIX）Sl）yTricine-SDS-PAGE2.1.2 LOS及OS的抗原性LOS.OS与兔抗百日咳杆菌全弟体超免血清在琼脂糖免疫双扩散图上均呈现清晰光滑的免疫沉淀线,提示两者抗原性良好,见图3。2.1.3核酸及蛋白含ht结果经过水解后,OS中的核酸和蛋白含址有进一步的降低,最终得到的OS核酸质辱分数为2.55%,蛋白质址分数为1.09%,见表I。2.1.4OS的结构百日咳杆菌OS的600MHz核磁共振波谱II化学位移图显示，在，HNMR中4.7ppm（注：1ppm=I.OxlO-6）处的12个吸收峰是表1LOS及OS的化学特性Tab.l(Hirmi

25、calpnqxTtifsoflijxiH也.zm寸hwideandoligosa<*chari(l<*样品核酸质ht分数（%）蜀白质量分数（）LOS5.911.75OS2.551.09各个单糖的端基质子知；3.04.4ppm的吸收峰是环质子的吸收峰；2.88ppm的单峰是FucNMr的甲基峰；2.06、2.03、1.99、1.89ppm分别是EucNAc、（；kNAc.Man2NAc和Man3NAc的甲基峰；1.46ppm是Fuc的甲基峰，见图4,上述结果与文献11报道的百日咳OS600MHz*HNMR图谱的结果一致5.55.01.54.03.53.()2.52.01.51.00.

26、50ppm注：I|>|H1I=I.Ox106图4OS600MHz(HNMR图谱Fig.4600MHz1HNMRspectrumofoligosaccharide2.2结合物的检测结合物经SephacnlS-300纯化后的化学分布,221结合物的理化性质游离多糖质ht分数为收集A=0.25之前的部分，【叫收率为27.35%.井II.().45%,多糖蛋|'|质M分数比为0.75,见&2叮与游离多糖有效分离，见图5衰2百H咳杆萌LOS结合物的基本待性Tab.2Priinan<-haraclfrisli<-sofconjugaks多慵质砒浓度(jig/ml.)蛋门质

27、ht分数(Jig/nil.)源离多糖质ht分数(%)多糖/蛋门位结介率(%)呵收率(W)165.76221.010.45().7565.1727.35图5结合物纯化层析图谱Fig.5Chnimalographicprofileof(*onjugaltkspuriGcalion注:i.站合物;2.纶抗全ar体血清;3.抗it血清图6结合物的琼脂糖免疫艰扩散Fig.6DelrftionconjugatesbyAgarosedoubleimmuncMliffusionOS成帝衣度(pg/mL)图7百日咳杆菌LOS和结合物的抑制ELISA曲线Fig.7Inhibition-ELISAcurveofli

28、|M>|M>lysa<-chari(lt*aiulconjugatefrom".pertussis2.2.3抑制ELISA分析抗原性百日咳杆菌OS与2.2.2结合物招别试瀚结合物与纶抗百日咳杆前全前体超免血清及兔抗'IT超免血清均可形成明显的免疫沉淀线，且两条沉淀线可融合在一起.证明结合物是由I'iII咳杆菌QS与TT共价结合形成的.见图6。结合物的抑制曲线儿乎-完全而合.抑制率达到5()口时所需抗原浓度没有明显变化.表明结合物保留LOS的抗原性。百日咳杆菌LOS抗原对百日咳杆菌阳性血清的抑制率可以达到100%,而相同浓度下，载体蛋白TPw对阳性血清

29、的抑制率为0,表明椅测方法特异性良好，见图72.3免疫原性小鼠血清抗LOSIgG含量结果显示,LOS组与结合物组免疫后各针次间的差异均有统计学意义(P<0.001)。两种剂量下，免疫应答均有明显的针次加强效应；与第2针相比，第3针免疫后血清抗LOSIgC含量明显增高，差异均有统计学意义(P<0.001)o结合物二组诱导产生抗体的能力略高于结合物一组，经统计学分析,结合物二组第3针免后血清中抗LOSIgG含量与结合物一组差异无统计学意义(P=1.00.P>0.05)。LOS与结合物免疫小鼠后诱导的血清抗LOSIgG含量，见表3。表3LOS与结合物免疫小鼠后诱导的血清抗LOSIg

30、G含址Tab.3Thecontentofanti-LOSIgGinmiceserumsinducedbyLOSandconjugateimmunizations组别抗原抗LOSIgG含量第2针免后14d(28d)第3针免后14d(42d)结合物一组OS-TTU113.15(5.03,34.34)236.53(157.06,388.18)结合物二组OS-TTU127.02(15.28,75.04)288.47(213.19,390.38)OS组OS2.87(1.33,6.18)6.12(3.73,10.03)注：()为95%可信K间。3讨论由f针对细菌最外层多糖抗原的抗体都具有杀菌活性，因此.多

31、糖抗原一般都是细菌疫苗研制的目标抗原，所以研究建立了百日咳杆菌LOS的提取纯化方法。通过改良热酚水法提取LOS1,2,由于核酸含量:较高，通过酶解法去除核酸，在提取LOS过程中会加入醋酸钠、氯化钙、乙醇等溶液，这些物质对多糖化学检测和结合都有一定的影响，因此要通过透析除去里面含有的小分子杂质，经过纯化最终得到的OS核酸质量分数及蛋白质量分数均低f3%。具有两亲性质的LPS是革兰阴性菌细胞外膜的改要组成成分，而百日咳杆菌细胞壁外膜的组成成分为LOS'e,与其他革兰阴性细菌相比，百日咳杆菌最外层糖链较短，仅由三个单糖组成，因此相对分子质最较小，所以不会像其他细菌LPS一样在SDS-PAGE

32、上出现梯状条带，而是在电泳图谱中显示有两条条带3叫.迁移慢的是完整的LOS,含有类脂A、核心OS和末端三糖,迁移快的仅含有类脂A和核心OS。类脂A为LOS的毒性中心，对于内毒素毒性起决定作用，所以不能作为免疫原直接免疫人体。通过低浓度的乙酸加热水解，类脂A与LOS内核之间的酮甘键对酸敏感,从而造成断裂水解后进行超速离心,类脂A由其疏水性形成相对分子质虽较大的聚合体从而在离心过程中沉淀下来,()S处于上清中。因此得到了无内毒素毒性的OS。通过凝胶层析进一步的降低核酸和蛋白质的含虽增加了工艺的稳定性，降低了产品的批间差异。百日咳LOS产生免疫反应的主要位点是末端三糖通过600MHz核磁共振波谱仪测

33、定'H化学位移图结果证明所提取的百H咳杆的OS化学结构正确，且末端三糖未破坏。这为针对这些功能基团进行结合反应时提供了充实的依据。研究中通过CDAP活化OS上的羟基与TT、h上的豚基直接结合制备成结合物。抑制EL1SA结果显示，制备的结合物没有破坏LOS的抗原性，抗原性得到良好的保留。小鼠免疫学数据显示，由于OS抗原属于胸腺非依赖型抗原，其免疫原性较弱，结合物采用两种不同的免疫剂ht免疫小鼠后都诱导产生了很高的免疫应答，而H.均有剂次加强效应,表明制备的结合物有很好的免疫原性且具有T细胞依赖的反应特性，成功将多糖由胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原。综上所述,研究中成功提取纯化了百日

34、咳杆菌LQS,纯度较高，结构正确。以此制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫原性。因此，将百日咳杆菌OS与T1h结合是制备百日咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径。同时提示百日咳杆菌OS结合物"能是改善现有疫苗效果的潜在抗原成分。参考文献IBLACKKE.COUSENSS,JOHNSONHL.elal.GIoImI,regional,andnationalcausesofchildmortalityin2(X)8：asystrmalicu-naly»isJ.Lan.et,2010,375(9730)：1969-1987.21CHIAPP1NIE.STIVALA.GALLIL.el

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