絮状单位测定与小鼠体内中和试验法检测TAT效价的比较.docx

1、论著絮状单位测定与小鼠体内中和试验法检测TAT效价的比较段丽娟，梁桂香，王晖玲，杨俊杰，张金兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心.甘肃兰州.730046摘要：目的为了更好地进行生产质量控制，快速准确地测定破伤风抗毒素（TAT）效价.以统计分析絮状单位测定法（体外法）和小鼠中和试验法（体内法）测定TAT效价的相关性。方法对2010-2013年破伤风抗毒素生产过程中的原料血浆、原液的絮状单位值与小鼠中和效价进行了统计分析和比较"结果体外法和体内法检测TAT原料血浆和原液效价的相关系数分别为上拳=0.7943子<0.001和=0.9016,P<0.001,均

2、呈显著性正相关。结论体外法可指导或替代体内法TAT效价测定应用于生产过程中间品的质量控制。关键词:破伤风抗毒素；絮状效价;小鼠中和效价;相关性中图分类号：Q939.9文献标志码：ADOI：10.13309/ki.pmi.2014.01.008ComparisonoftitersbetweenflocculationinvitroandneutralizationinvivooftetanusantitoxinDUANU-juan,LIANGGui-xiang,WANGHui-ling,YANGJun-jie,ZHANGJinhinzhouimtitmeofbiologicalproductsC

3、o.IldtCenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,lnnzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:ZHANGJin,E-mail:LXS_zliangjinAbstract:ObjectiveInonicrtocontrolthequalityofTATanddetecttiterfortetanusantitoxinquicklyandaccurately.MethodTATwereinvestigatedforcrudeplasmasandbulksfrom2010to

4、2013,andthecorrelationwasstatisticanalyzedbetweenneutralizationpotency(lU/mL)invivoandlevelsofantibodytilermeasuredbyflocculation(Lf/ml)invitroforantitoxin.ResultThecoefficientofcorrelationbetweenflocculationtitersinvitroandneutralizationpotencyinvivoforthecrudeplasmaandbulkis皿球=0.7943(P<0.001)an

5、drbo|k=0.9016(P<0.001),respectively.Therearebothsignificantlycorrelatedbetweenthetwomethods.ConclusionThemethodinvitrocouldbeusedasqualitycontrolofTATtoguideand/orreplaceofthemethodinvivo.Keywords：Tetanusantitoxin(TAT);Flocculationtiter;Neutralizationtiterinvivo;Correlation破伤风抗毒素（Tetanusantitoxin

6、,TAT）系免疫马所得的血浆经胃酶消化后纯化所获得的抗毒素球蛋白制剂。作为特异性抗体.其中和破伤风毒素的能力是产品质量的关键指标，即抗体效价。目前，其检测方法按照中国药典三部（2010版）附录中的小鼠试验法进行测定，该方法耗时（35d）、费力、重复性差,并旦需要使用大威的实验小鼠。WHO建议使用体外法代替体内法进行抗毒素中和效价的测定，目前，文献报道的体外法有絮状单位测定法.ELISA法、免疫扩散法等。絮状单位测定法作者简介:段丽婿，医学生物学工程师，主要从事抗毒索类制品的纯化及检测工作。通讯作者：张金.E-mail:IZS_zhanR|in依据抗毒素与预先标定的类毒素在适当的含量、比例、温度

7、、反应时间等条件下，在试管中发生抗原-抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，根据类毒素的絮状单位值确定抗毒索的絮状效价。此方法操作简便易行、省时省力，对抗毒索中间品效价的判定以及指导成品中和抗体效价（体内法）的测定都具有很大的意义。实验研究中对近三年来TAT生产过程中的原料血浆、原液的絮状单位效价以及小鼠中和效价进行了抽样统计分析和比较，以探讨两种效价测定方法的相关性。1材料与方法1.1材料1.1.1破伤风标准毒素破伤风标准毒素批号为11；破伤风抗毒素国家标准品批号为0041,由中国药品生物制品检定研究院提供。1.1.2破伤风类毒素(75I£/mL)参考品、破伤风抗毒素原料血浆、原液

8、均由兰州生物制品研究所有限责任公司提供。1.1.3硼酸盐缓冲液称取四硼酸钠(Na2B4O7-10H20)0.5gx硼酸4.5g、氯化钠8.5g,加双蒸水溶解并稀释至1000mL,过滤，灭萌后pH值为7.07.2。1.2方法1.2.1小鼠中和试验法测定破伤风抗毒素效价按中国药典三部(2010版)附录XIF破伤风抗毒素效价测定法(小鼠试验法)进行测定口)o1.2.2絮状单位法测定破伤风抗毒素效价将破伤风抗毒素加硼酸盐缓冲液稀释至适宜絮状单位，按每管间隔0.02mL吸取供试品，分别加入5支絮状反应管，吸取类毒素参考品1.0mL快速准确加入上述絮状反应管内，摇匀，置4550丁水浴中，连续观察，记录絮状

9、出现次序和时间，按下式计算：供试品絮状单位(U/mL)=(LFx*/V2)xn式中HP为类毒素参考品絮状单位(Lf/mL)；匕为类毒素参考品使用体积(mL)；匕为最先出现絮状时供试品的使用体积(mL),几为供试品的稀释倍数。1.2.3统计分析对两种效价测定方法进行统计学相关分析和回归分析。2结果2.1体外法与体内法测定破伤风抗毒素原料血浆效价的统计学分析从20102013年破伤风抗毒素原料血浆中抽取30批，统计其絮状单位效价以及小鼠中和效价，并进行统计学相关性分析，结果见表1所列和图la所示。30批原料血浆效价的体外法检测范围为1250-2250Lf/mL,体内法检测范围为16002300lU

10、/mL,两种方法检测结果的相关系数为r=0.7943,P<0.001,表明对于破伤风抗毒素原料血浆,体外法与体内法检测效价呈正相关，且相关性显著。原料血浆批号絮状单位Lf/mL动物效价lU/mL原料血浆批号絮状单位Lf/mL动物效价lU/mLXJ-2010090118752000XJ-2011110222062000XJ-2010100120002100XJ-2011120116071700XJ-2010110117002000XJ-2011120220001900XJ-2010120120831900XJ-2011120318751800XJ-2011020118001900XJ-20

11、12010118752000XJ-2011030117051800XJ-2012020122502100XJ-2011030218001900XJ-20120301】3641600XJ-2011040J18002000XJ-2012040115001600XJ-2011050116071800XJ-2012050115001600XJ-2011060117862000XJ-2012050212501600XJ-2011060215001800XJ-2012060115001800XJ-2011070118752000XJ-2012110218752000XJ-2011080115001700X

12、J-2012120115001800XJ-2011090117051900XJ-2013010120452000XJ-2011110115001800XJ-2013060120502300表1破伤风抗毒素原料血浆絮状单位效价与动物中和效价的统计分析Tab.1StatisticanalysistitersofflocculationandneutralizationinvivoofTATplasma相关性分析r=0.7943P<0.0012.2体外法与体内法测定破伤风抗毒素原液效价的统计学分析从2010-2011年破伤风抗毒黄原液中随机抽样30批，统计其絮状单位以及小鼠中和效价，并进行统计

13、学相关性分析，结果见表2、图lb。30批原液效价的体外法检测范围为2500-4090Lf/mL,体内法检测范围为25004200IU/mL,两种方法检测结果的相关系数为=0.9016,P<0.001,说明对于破伤风抗毒素原液，絮状单位以及小鼠中和效价呈正相关，亦即体外法与体内法检测效价的相关性显著。240024()0260()28(H)3()0()320034()。3h(M)380()I00012<H>表2破伤风抗毒素原液絮状单位效价与动物中和效价的统计分析Tab.2StatisticanalysisofTATtitersbetweenflocculalionandneutr

14、alizationinvivofrombulk原液批号絮状单位L£/mI,动物效价IU/mL原液批号絮状单位IX/mL动物效价IU/mLM-2010090132143600M-2011040134613600M-2010090232143300M-2011040232143400M-2010090332143400M-2011040337503800M-2010100140004100M-201104()428122900M-2010110125002500M-2011050131253400M-2010110232142900M-2011050234093700M-2O1O11O3

15、28132700M-20110503288432()0M-2010120130003200M-2011050434093100M-2O1O12O230003300M-2()11060128122800M-2010120330002900M-2011060228】22900M-2OJ1O2O134093800M-2011060328123100M-2011020237504000M-2011060428122800M-2011030140904200M-2011070128123000M-2011030237503600M-2011070228133100M-2011030332143400M-

16、2011070328133000相关性分析r=0.9016P<0.001絮状效价絮状效价图1破伤风抗毒素原料血浆(a)、原液(b)絮状单.位效价与小鼠中和效价的相关性分析Fig.1CorrelationofTATtitersbetweenflocculaHonandneutralizationinvivofromplasma(a)andbulk(b)3讨论破伤风抗毒素是预防和治疗破伤风的传统制品，抗毒素作为特异性抗体，效价高低往往决定制品的质量及使用效果，传统的抗毒素效价测定法为1981年WHO颁布的小鼠中和试验法，但此法需要大量实验小鼠。因此有必要采用体外测定法指导和/或替代体内法。絮

17、状单位测定法因其操作简便,因此也是应用最为广泛的一种体外测定法。实验中通过TAT生产的原料血浆以及原液进行的统计，对其体外絮状单位以及小鼠体内中和效价进行了相关和回归分析，相关系数分别为站浆=0.7943,P<0.001和满液=0.9016,P<0.001,表明这两种效价测定方法对于原料血浆以及原液均有显著相关性，且对于原液的相关性更好。分析其原因，可能为原液中马免疫球蛋白F（ab92纯度较高，其他杂蛋白含量较少，从而对检测的干扰较小。而血浆中含有大量的白蛋白、纤维蛋白等非活性免疫球蛋白杂质，可能会对絮状效价或小鼠中和效价的测定起到不同程度的干扰作用。总之，在TAT常规生产的中间品

18、质最控制中,体外絮状单位测定具有快速、准确、费用低、耗时少、易检测等优点，可用于指导或替代小鼠试验法测定效价,达到以最少的资源进行生产过程中的质量控制。参考文献国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)S.北京：中国医药科技出版社,2010：附录83.1 TheakstonRDG,WarrellDA,GriffithsE.ReportofaWHOworkshoponthestandardizationandcontrolofantivenomsJ.Toxicon.2003,41：541-557.3,MariaWS,CanibuyMO,CostaJO,etal.Neutralizingpotencyofhorseantibothropicantivenom,correlationbetweeninvivoandinvitromethodsJ.Toxicon.1998,36(10):1433-1439.4 高祖新，编.医药数理统计方法M.5版,北京:人民卫生出版社,2011.5 WHO.ProgressintheCharacterizationofVenomsandStandardizationofAntivenoms'M'.WHOOffsetPublication,WHOGeneva,19