白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用.docx

1、论著.白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用张霖阳'，杨冰2,王瑚，张娜'，赵俊'，王玲I1. 北京天坛生物制品股份有限公司细菌性疫苗研究室，北京100176；2. 北京天坛生物制品股份有限公司质演保证部，北京100176；3. 北京天坛生物制品股份有限公司菌苗室，北京100176摘要：目的建立测定吸附无细胞百白破联合疫苗中白喉类毒素酶联免疫检测(ELISA)方法，并进行验证及初步应用。方法以高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法，确定线性范围同时验证该方法的重复性和特异性等确定检浏限度,并初步应用。结果DT含量在00.0160L£

2、/mL范围内反应曲线线性关系良好(0.99)。该方法与破伤风类毒素(Tetanustoxoid,TT)、百日咳毒素(Pertussistoxin,PT)、百日咳丝状血凝素(Filamantoushemagglutinin,FHA)与黏着素(Pertactin.Pm)无明显交叉反应，重复性好、特异性较强，精密度及准确度验证均符合常规质控要求，通过验证确定的准确检测范围为0.0008-0.0160Lf/mL；检测限度为0.0008U/mL。该方法对DT抗原进行了吸附率的检测，同时检测了10批白喉类毒素原液与中华人民共和国药典三部2010年版规定的絮状单位检测方法进行对比,变异系数低于20%。结论建

3、立了白喉类毒素双抗体夹心ELISA检测方法，为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中白喉类毒素含量的质量控制提供了有效技术手段。关键词：白喉类毒素;酶联免疫吸附试验;吸附无细胞百白破联合疫苗中图分类号：R378.7+l;R392-33文献标志码：A文章编号：1005-5673(2016)02-0045-05DOI：10.13309/ki.pmi.2016.02.008EstablishmentandpreliminaryapplicationofaquantitativeELISAindetectionofdiphtheriatoxoidZHANGLin-yang*,YANGBing,WANGXu

4、n,ZHANGNa,ZHAOJun,WANGLing,DepartmeniofBacterialVaccineResearch,BeijingTianlanBiologicalProductsCo.,Lld.,Beijing100176,ChinaCorrespondingauthor:WANGLing,E-mail:jinghuweibo®Abstract:ObjectiveTodevelopandpreliminaryapplicationadoubleantibodysandwichELISAinquantitativedeterminationofdiphtheriatoxo

5、id(DT)inDTaP(Diphtheria,tetanusandacellularpertussiscombinedvaccine,adsorbed).MethodsTlieDTpolyclonalantibodieswithahighpotencywereobtainedbyusingDTimmunizedrabbitantisera,andthedetectiveenzymelabeledantibodyassignalinordertodevelopadoubleantibodysandwichELISAinquantitativedeterminationofDTinDTap.Th

6、elinearrangewasdetermined,therepeatabilityandspecificityfortheELISAwereverified,anddetectionlimitwasdeterminedaswell.ThepreliminaryapplicationoftheELISAwasperformed.ResultsThebestlinearityofdose-responsecurvewasfoundinarangeof0-0.0160L£/mL(r>0.99).Thetestedresultwasnoapparentcrossreactionswi

7、thTT(Tetanustoxoid),PT(Pertussistoxin),FHA(Filamantoushemagglutinin)andPm(Pertactin),redoubleantibodysandwichEUSAwasdevelopedinquantitativedeterminationofDT,itprovidedaneffectivetechnicalmeansinqualitycontrolofDTcontentintheproductionprocessofDTaPvaccine.Keywords：Diphtheriatoxoid;ELISA；Diphtheriatet

8、anusandacelluarpertussiscombinedvaccineadsorbed(DTaP)spectively,anditshowedanexcellentrepeatabilityandspecificityinreactionwithDT.TheverificationforprecisionandaccuracyfortheELISAwasinaccordancewithrequirementsfortheconventionalqualitycontrolmeasures.Thedetectionrangeandlimitationweredeterminedas0.0

9、008-0.0160L£/mLand0.0008Lf/mL,respectively.HieadsorptionrateofDTantigenand10batchesofDTbulkweredetectedbytheELISAandcomparedwithIJdetectionmethodpublishedin(PharmacopoeiaofThePeople*sRepublicofChinaVolumeID2010edition,theresultshowedthatthecoefficientofvariationwaslessthan20%.ConclusionThe基金项目:

10、国家重大科技专项项目(2012ZX09201301-001)作者简介:张霖阳(I979-),女.助理研究员，从事吸附无细胞组分百白破联合疫苗的研究工作。通讯作者:王玲，助理研究员.E-mail：jinghuweibo©白喉类毒素(Diphtheriatoxoid,DT)是用白喉杆菌在适宜培养基中培养产生的毒素，经甲醛脱毒、精制并加入氢氧化铝佐剂后制成的疫苗，用于预防白喉，该类毒素是吸附无细胞百白破联合疫苗中主要组分之一。通常，对DT纯度和抗原性的质量控制以及与氧氧化铝佐剂吸附后的吸附效果用絮状单位(Lf)测量法和疫苗效价测定法进行检测。但是，絮状单位测量法是检测人员以肉眼观察，较为主

11、观，容易产生误差;而使用动物试验检测疫苗效价的方法具有一定的局限性。针对以疫苗免疫原性有几种白喉抗毒素的实验室分析方法，其中Vero细胞中和测定法公认为最准确，但在技术上非常烦琐,只有少数研究实验室使用。酶联免疫测定(ELISA)法具有广泛使用性，同时具有检测准确、特异性强、重复性良好等优点，能够用于白喉类毒素生产过程中的定量监控。实验中建立双抗体夹心EUSA法，验证其能否用于吸附无细胞百白破联合疫苗原液和成品解吸附后的白喉类毒素抗原含量检测。1材料与方法1.1样品与茵株DT抗原201501由北京天坛生物制品股份有限公司菌苗室提供。白喉类毒素原液(批号：DT2008(4)0501、DT2008

12、(4)0601、DT2008(4)0701sDT2008(4)0801、DT2010(4)0105.DT2010(4)0207、DT2010(4)0303、DT2011(4)0101、DT2011(4)0204以及DT2011(4)0301均由北京天坛生物制品股份有限公司细菌性疫苗研究室制备；百日咳菌为北京天坛生物制品股份有限公司细菌室保存。12实验动物青紫蓝家兔,由北京天坛生物制品股份有限公司小动物室提供。1.3主要试剂及仪器福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、琼脂糖，均购自美国Sigma公司；白喉类毒素标准品购自英国国家生物制品检定所(NIBSC),批号为02-176；HRPCALBIOCHEM

13、购自Darmstadt公司；MuLtiskan酶标仪购自美国Thermo公司；96孔聚苯乙烯酶标板，购自美国COASTAR公司。1.4抗体制备及纯化取100pig/mL适宜质量浓度的DT抗原与等体积的完全福氏佐剂均匀混合,经胴窝淋巴结免疫家兔;间隔1周用200pig/mLDT抗原和等体积福氏不完全佐剂加强免疫1次，第3次用400jig/mLDT抗原加强免疫7天后采血，分离血清抗体。用免疫双扩散法测定血清抗体效价，辛酸硫酸铉法纯化抗体。1.5抗体的标记采用过碘酸钠氧化法制备酶标记抗体。将5mgHRP溶于新配制的1mL0.30mol/LpH8.1碳酸钠中，加0.1mL1%二硝基氟苯(FDNB)无水

14、乙醇溶液，在室温中混合后，再加入1mL0.06mol/L过碘酸钠(Na。)，置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时，加1mLO.16mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应终止,然后于4X.0.10mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液透析，换液3次。在3mLHRP-醛基溶液中，加入5mg硼氢化钠(NaBH,溶于1mL的碳酸盐缓冲液中)，置于室温2h,于4丁冰箱过夜,然后用PBS洗液充分透析,离心去除沉淀物，上清液为酶标记结合物。1.6 双抗体夹心EUSA方法的建立16.1确定包被抗体及酶标抗体工作浓度采用棋盘滴定法确定包被抗体及酶标抗体的配伍关系。将纯化兔抗DT抗体分别稀释为l、5、1

15、0、15"mL质量浓度包被酶标板，用稀释度分别为1:1000J:2000J：4000J：8000、1：16000的酶标兔抗DT抗体,进行棋盘滴定，检测0.016、0.008、0.004、0.002、0.001.0.0005.0.00025ImL,系列稀释DT标准品，以含量为0.0160IJ/mL标准品的W63o>l.O,0-0.0160If/mL范围内所建立标准曲线相关系数r>0.99,阴性对照(NC)的4值<0.15,通过这三个条件选择出最佳的包被抗体及酶标抗体工作浓度。16.2双抗体夹心ELISA法将兔抗DT抗体用碳酸盐缓冲液(pH9.6)以1：3000稀释至1

16、0吗/mL,在酶标板中每孔加入100aL,于4T包被过夜;每孔加入200口封闭液(含1%BSA的PBS)37Y作用1h；封闭后加入用硼酸盐缓冲液(pH7.07.2)稀释的待检样品，每孔100pl，,同时设阴性对照孔(硼酸盐缓冲液),37T作用1h；用PBST洗涤3次,洗涤后每孔加入酶标抗体(1-8000稀释)100jiL,37r作用1h；洗涤后，每孔加入100叫,底物溶液,37T作用10min；最后每孔加入2mol/LH2SO4溶液50皿，终止反应,用酶标仪450nm波长处测定4值。1.7 双抗体夹心EL1SA法的验证17.1最佳线性范围在获得最佳ELISA试验条件的基础上，将DT标准品用PB

17、ST液稀释至0.016、0.008、0.004、0.002A001、0.0005.0.00025U/mLt绘制标准曲线，选择相关系数r>0.99对应的范围为该法的线性范围。1.7.2线性关系的重复性验证按照已确定的ELISA条件，建立絮状单位(Il/mL)对应4450/4630值的直线回归方程，确定最佳线性关系，重复试验10次，计算10次不同时间检测的r值，值均应0.986.观察建宅的线性关系的垂复性。1.7.3特异性验证将0.0160Li/mL的DT和破伤风类毒素样品，以及其他待检品100ng/mL的百日咳毒素、百日咳丝状血凝素、与黏者素和PBST液分别取100皿,加入96孔聚苯乙烯酶

18、标板,进行双抗体夹心ELISA法的特异性检测。以PBST液为阴性对照(NC)的4颂国值2.1倍即Cutoff值作为判定阴性与阳性的标准。1.7.4准确度、精密度的验证及检测限度的确定用EL1SA方法检测准确稀样的0.0128A0064.0.0032、0.0016.0.(XX)8、0.0004、0.0002U/mLDT标准品，每一稀释度做io孑L,计算试验内测定均值的回收率、标准偏差$及变异系数CK不同时间共测定3次，计算试验间测定均值的回收率、标准偏差S及变异系数CK同时确定检测限度。1.8初步应用1.8.1l)T吸附率检测向务轼化铝佐剂中加入DT,使佐剂的终质雄浓度达到1.3mg/mL.DT

19、的终浓度分别达到25Lf/mL、75Lf/mL、125Lf/mL.200U/mL.250Il/mL.500IJ7mLo静置1h后离心取上清,测定上清的絮状单位，结合DT的加入量计算得到其吸附率按公式:吸附率=(解吸附DT-未解吸附DT)/解吸附DT,计算DT吸附率。1.8.2测定1()批白喉原液的絮状单位用中华人民共和国药典2010版(三部)类毒素絮状单位测定法二和建立的双抗体夹心ELISA法检测1()批白喉类毒素原液，计算白喉类毒素含量。2结果2.1抗体效价测定采用免疫双扩散法测定DT抗血清，结果显示效价可达1：32,见图1。2.2包被抗体和酶标抗体工作浓度的确定包被抗体质仙浓度为10ag/

20、mL、前标抗体工作浓度为8000倍稀释时.建立的双抗体夹心ELISA法线性关系良好,r>0.99,建立方程y=100.71.+0.0825,见图2。2.3双抗体夹心ELISA的检证2.3.1线性范围在00.01601mL范围内反应曲线线性关系良好U>0.99),建立方程作1OO.71X+O.O825,见图2。2.3.2线性关系的重复性验证重复试验10次，10次不同时间检测的r值，结果见表1。无论r值还是尸值均>0.99,表明实验中所建立的标准曲线具有较好的可重复性C注：1.抗DT血清I：2；2.抗HT血清I：4；3.抗DT血清I：4；4.抗DT血清1：8；5.抗IJT血清I:

21、16；6.抗DT血清I：32；7.NIBSC的DT耗准品图1免疫双扩散法测定DT抗血清效价Fig.1Determinationof,x>tencyforDTanti-serumbyadoublediffusionmethod图2DT的双抗体夹心ELISA法标准曲线的建立Fig.2ThestandanlcurveforadoubleantilxxlysandwichE1JSAindetectionDT衰1线性关系的重夏性验证Tab.1TheverificationrepeatabilityoflinearityfortheELISA次数r2f10.9900.99520.9940.99730

22、.9910.99540.9950.99750.9950.99760.9980.99970.9950.99780.9910.99590.9900.995100.9940.9972.3.3特异性验证双抗体夹心ELISA法检测DT抗原的特异性，见表2。对含技高的破伤风类毒素、百日咳毒素、百日咳丝状血凝素和黏着素的检测结果均为阴性，而对含帝为80Lf/mL的DT检测结果哀2双抗体夹心ELISA法的特异性验证Tab.2VerificationofspecificityforadoubleantibodysandwichELISA样品含最450/6M>值DT80Lf/mL1.175rr80Lf/mL

23、0.043PT100ng/mL0.015EHA100ng/mL0.030Pm100ng/mL0.017NC0.02mol/mL0.056注：以PBST液为阴性对照(NC)。为强阳性，表明该法具有良好的特异性。表3批内、批间精密度及准确度结果Tab.3Theverificationfortheprecision,accuracyandthequantitationlimit批内(n=10)批间5=3)(Lf/mL)测定值(L£/mL)sCV(%)回收率(%)测定值(U/mL)sCV(%)回收率(%)0.01280.011750.574.8591.800.011880.816.4692.

24、840.00640.006850.314.49107.020.006600.235.14103.160.00320.003660.153.96114.460.003460.239.43108.210.00160.001470.096.1592.010.001780.141.99111.100.00080.000860.155.69107.640.000750.0912.3594.25DT理论值2.4初步应用法和絮状单位测定法同时检测DT含量，结果见表2.4.1两种不同测定法检测DT类毒素含量的比4。二者间的变异系数低于20%,表明实验中建立较以10批白喉类毒素原液,用双抗体夹心ELISA的EL

25、ISA法可以用于DT原液的含量测定。表4两种方法检测DT原液的含最比较样品双抗体夹心eusaDT含量(10-3U7mL)絮状单位测定法DT含M(10'3U/mL)变异系数(%)平均变异系数(%)DT2008(4)0501819107519.1210.20DT2008(4)0601928120018.08DT2008(4)0701872I0009.67DT2008(4)08011166100010.60DT2010(4)0105876105012.78DT2010(4)0207106411253.94DT2010(4)0303117810508.12DT2011(4)0101100611

26、006.31DT2011(4)0204112811001.78DT2011(4)0301936110011.39Tab.4ComparisonofDTcontentinthebulkbytwotests2.3.4准确度、精密度及检测限度的验证批内测定0.0128、0.0064.0.0032、0.0016、0.0008Lf/mL的DT,准确度较好(回收率：91.80%114.46%),精密度较佳(CV：3.96%6.15%)；批间测定0.0008、0.0016、0.0032、0.0064、0.0128Ii/mL的DT含量，准确度较理想(Recovery；92.84%111.10%),精密度好(C

27、V：1.99%12.35%),而对0.0006.0.0004Lf/mLDT的三次测定结果重复性差，准确度也不理想，回收率为145.24%，超过了测量限量，因此该方法的检测限度为0.0008Lf/mL,结果见表3。2.4.2DT吸附率检测采用双抗体夹心EUSA法检测显示，不同含量的DT吸附率如表5所列，在DT成品原倍样品中吸附率为95%,随着样品的含量增加，其吸附率下降，到DT含量500L£/ml时,吸附率仅为42%。表5DT吸附率检测结果Tab.5ResultsofdetectedDTadsorptionrate含量(U/mL)吸附率()25957586125722005625052

28、500423讨论吸附无细胞百白破联合疫苗是一种以白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳毒素、丝状血凝素和黏着素为主要成分的组分疫苗。该疫苗已在国内和国外推广应用，而其质髭控制已经成为规模化生产的工作重点。实验研究中所建立的白喉类毒素双抗体夹心EUSA法适用于对吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中的白喉类毒素进行监控。实验中所使用的高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法，在确定最适包被抗体含量:及酶标抗体含髭的配伍时在00.0160Lf/mL区间范围能够建立较理想的标准曲线，相关系数r>0.99,重复试验10次，10次不同时间检测的r值和r2值均0.99,表明实验中建立的

29、标准曲线具有可重复的较佳线性；同时经验证未见与高浓度的TT.PT.FHA和Prn之间出现交叉反应，与PBST的检测结果也为阴性，而对80Lf/mL的DT检测结果为强阳性，说明实验中建立的双抗体夹心ELISA法检测DT具有良好的特异性和检测可驱的稳定性，也说明其制备的多克隆抗体具有良好的特异性。通过对该方法的准确度和精密度的验证确定可靠测量范围为0.01600.0008Lf/mL,检测限度为0.0008Lf/mL。因此，建立的该方法具有灵敏度高,能够精确检测白喉类毒素的含量的优点。实验中应用双抗体ELISA法对吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中进行了吸附率的检测。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)和美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)均对DT的吸附率进行了规定。WHO要求DT的吸附率至少达到80%,FD