引物设计步骤与要点

1、弓丨物设计 step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用 Primer Premier5 搜索引物 打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequenee, 出现输入序列窗口， Copy目的序列在输入框内（选择 As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 此窗口可以链接到 引物搜索”、引物编辑”以及 搜索结果”选项，点击Search按钮，进 入引物搜索框，选择PCR primers ”，P

2、airs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。 在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300500bp. 点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rati ng ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在引物窗口 ”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，弓I物的各种信息等。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3 '不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如 GGG或CCC

3、,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在5570度之间，GC%应该在45%55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结 构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何， 是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oli

4、go来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. 在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择 File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。3、用Oligo验证评估引物 在Oligo软件界面，File菜单下，选择 Open，定位到目的eDNA序列（在primer中，该 序列已经被保存为 Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为 Internal Stability （ Delta G ）窗 口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下

5、角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change Currentoligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击 Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 Analyze中，第一项为 Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息， 其中包括引物的 Tm值，此值 Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比 Primer5 中引物

6、的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3端的Delta G.3 '端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。 Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引 物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择 Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4

7、.5kcal/mol ,结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3'端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 Analyze中第三项为Hairpin Formation ，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物, 同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过 3个。Analyze中第四项为Composition and Tm ，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和 Tm值。上下游引物的 GC%需要控制在 40%60%，而且上下游引物之间的 GC%不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest

8、neighbormethod、 GC method 和 2(A + T) + 4(G + C)method，最后一种应该是 Primer5 所采用的 方法，Tm值可以控制在 5070度之间。第五项为False Priming Sites ,即错误引发位点， 在Primer5中虽然也有 False priming分析, 但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500 ,错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。 Analyze中，有参考价值的最后一项是PCR”在此窗口中

9、，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于 PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。 引物评价完毕后，可以选择File Print,打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有 Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息， 多达数页。因此，打印前最好关掉 Tm窗口和Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(若存在可疑的异常的话)和PCR窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast

10、分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。、引物设计过程中的心得1、Primer 5.0搜索引物 Primer Length我常设置在18 30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求 的除外，如加个酶切位点什么的。 PCR Product size最好是100 500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来， 条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 Search parameters 还是选 Manual 吧，Search stringency 应选

11、High , GC含量一般是 40 60 %。其它参数默认就可以了。 搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送 Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端丝个A或T,或引物内部连续的 G或C太多， 或引物3端淳个G或C,这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如 果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。2、Oligo 6.0评估引物 在analyze里，Duplex Formation 不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，Themost stable 3 '

12、-Dimer 绝对值应小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在 PCR退火温度在65。的时候， The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol 没有问题。 Hairpin Formation 根据黄金法则 False priming sites: Primer 的priming efficiency 应该是错配地方的 4倍左右，更多当然 更好。 在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperatur

13、e数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害 越稳定，所以G绝对值越大结构越稳定。3、其他两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了 oligo里，退火温度也不一样。3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50。的退火温度肯定和65。对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol以下（丁香园战友