微生物限度方法学验证全解

1、微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）;控制菌检查法（中国药典2015 年版四部1106）;非无菌药品微生物限度标准（中国药典 2015年版四部1107）;抑菌效 力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表1菌种菌种名称菌种代数菌种状态厂家大肠埃希菌CMCC(B)441023正常金黄色葡萄球菌CMCC（B）260033正常枯草芽抱杆菌CMCC（B）635013正常浙江省食品药品检验白色念珠菌CMCC(F)980013正常研究院黑曲霉CMCC(F)980033正常乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）500943正常表2

2、培养基培养基名称批号厂家营养肉汤培养基150222北京三药科技开发公司改良马丁培养基150134北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基150215北京三药科技开发公司营养琼脂培养基150317北京三药科技开发公司玫瑰红钠琼脂培养基150323北京三药科技开发公司胆盐乳糖培养基150127北京三药科技开发公司胆盐硫乳琼脂培养基150214北京三药科技开发公司四硫磺酸钠亮绿培养基150416北京三药科技开发公司MUG口养基150122北京三药科技开发公司曙红亚甲监琼脂培养基150137北京三药科技开发公司二糖铁琼脂培养基150207北京三药科技开发公司表3对照用培养基对照培养基名称批号厂家营养肉汤

3、对照培养基135004-201103中国食品药品检定研究院营养琼脂对照培养基135003-201002中国食品药品检定研究院玫瑰红钠琼脂对照培养基135005-201002中国食品药品检定研究院胆盐乳糖对照培养基135006-201404中国食品药品检定研究院胆盐硫乳琼脂对照培养基135010-201102中国食品药品检定研究院四硫磺酸钠亮绿对照培养基135020-201101中国食品药品检定研究院MUG寸照培养基135012-201001中国食品药品检定研究院曙红亚甲监琼脂对照培养基135009-201102中国食品药品检定研究院三糖铁琼脂对照培养基表4试剂试剂名称批号级别磷酸二氢钾1308

4、26分析纯氢氧化钠20150117分析纯氯化钠20140714分析纯聚山梨酯8020141011化学纯95% 醇15070722药用级二甲氨基苯甲醛20140402分析纯盐酸20140533分析纯稀释液：(1) pH6.8缓冲液取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液 250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至 1000ml,摇匀，既得。(2) 0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml,过滤，分装、灭菌。(3) 0.05 %( ml/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 0.5ml ,用0.9 %无菌氯化钠溶液溶解并稀释至 1000m

5、l,滤过，分装, 灭菌，备用。(4) 靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%L醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml 徐徐滴入。三、菌液的制备1 细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养 24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48 小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。接 种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养 7 天，加入 5ml 含 0.05（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱，然后吸出抱子悬液

6、（用带 有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子 数 50100cfu 的抱子悬液。 菌液制备后若在室温下放置， 应在 2 小时内使用， 若保存在 28°C可在24小时内使用。2 控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培 养基中，培养 24小时。用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 10100cfu 的菌悬 液。菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保存在28C可在24小时内使用。四、验证内容1 、计数方法验证将制备好的菌悬液用 0.9%无菌氯化钠溶液以每 10倍体积分别稀释成一系列浓

7、度菌 悬液，利用血球计数板计数， 确定具体菌悬液浓度， 取接近于 10cfu-100cfu 的稀释浓度， 选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。经过验证当原液稀释至 10-6时，菌液浓度接近 100cfu/ml。2、适用性检查2.1 细菌、霉菌、酵母菌取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌各1ml（内含菌约50100cfu）,分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，混匀， 凝固，置3035C培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml（内含菌约50100cfu）, 注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全） ，立即倾注玫瑰

8、红钠琼脂培养基，每 株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2328C培养72小时，计数。同时，用 相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。其大小、形态应与对照培 养基一致，且数量应不小于对照培养基的 70%。细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查培养基名称菌种名称测试培养基（cfu）对照培养基（cfu）回收率（%）大小形态标准结论才口/J、碟1碟2平均碟1碟2平均营养琼脂拉H甘 培养基枯草芽抱杆菌87838595999787.6一致大小形态一致且回收率70%符合规定金黄色 葡萄球 菌88828594989688.5一致大小形态一致且回收率70%符合规定大肠埃希菌838684.595

9、959588.9一致大小形态一致且回收率70%符合规定玫瑰红钠拉H甘 培养基枯草芽抱杆菌848785.5999496.588.6一致大小形态一致且回收率70%符合规定金黄色 葡萄球 菌908688971019988.9一致大小形态一致且回收率70%符合规定大肠埃希菌888385.5929995.589.5一致大小形态一致且回收率70%符合规定培养基中细菌、霉菌、酵母菌的生长情况良好，回收率在80%，且与对照培养基状态一致，证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。2.2控制菌 2.2.1促生长能力取大肠埃希菌菌悬液0.1ml （内含菌约10100cfu）,分别置于胆盐乳糖培养基、MUG

10、培养基、营养肉汤培养基中；取乙型副伤寒沙门菌0.1ml （内含菌约10100cfu）,分别接 种于营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，取乙型副伤寒沙门菌0.1ml （内含菌约10 100cfu）涂布于胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基中；于35C培养18小时，同 时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照，每个培养基平行制 备2个平皿。胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、MUG培养基与对照管比较，被检培养 基管试验菌应生长良好；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基与对照培养基上生 长的菌落大小、形态特征应一致。2.2.2抑制能力取金黄色葡萄球菌100 cfu左右，注入无

11、菌平皿中，立即倾注胆盐乳糖培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置35T培养18小时，应 不得有菌生长。223指示能力取乙型副伤寒沙门菌10100cfu，接种于三糖铁琼脂培养基中，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035C培养18小时；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂 培养基指示能力见2.2.1中乙型副伤寒沙门菌测试结果，MUG培养基指示能力见2.2.1中大 肠埃希菌测试结果。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长的菌落大小、形态特 征、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。控制菌培养基适用性检查培养基名称促牛长性 （与对照比较）抑制性（与对照比较

12、） 金黄色平葡萄球菌指示性（与对照比较） 乙型副伤寒沙门菌结论菌种名称形态大小形态大小指示 反应胆盐乳糖培养基大肠埃希菌一致一致无生长-符合 规定MUG培养基大肠埃希菌一致一致-一致一致一致符合 规定营养肉汤培养 基大肠埃希菌一致一致-符合 规定乙型副伤寒 沙门菌一致一致-符合 规定四硫磺酸钠亮绿培养基乙型副伤寒 沙门菌一致一致无生长-符合 规定胆盐硫乳琼脂培 养基乙型副伤寒 沙门菌一致一致-一致一致一致符合 规定曙红亚甲蓝琼脂培养基乙型副伤寒 沙门菌一致一致-一致一致一致符合 规定三糖铁琼脂培养 基-一致一致一致符合 规定培养基的促生长性及指示性菌落生长状态一致，抑制性均无菌落生长，说明培养

13、基 适用性良好。3、抑菌性：取连续生产的三批样品进行测定3.1细菌、霉菌、酵母菌3.1.1供试液的制备：称取本品10g，加pH6.8缓冲液100ml,混匀，制成1: 10的供试 液。3.1.2试验组：取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和枯草芽抱杆菌菌悬液各1ml，分别加上述供试液1ml，注入平皿中，立即倾注1520ml温度不超过45C溶化的营养琼脂培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。31.3菌液组：取上述各试验菌液1ml，加入相应的培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入1520ml温度不超过45

14、C溶化的营养琼 脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养，每个培养基平行制备2个平皿。3.1.5回收率标准以供试品对照组为样品空白（Co）、以菌液组为对照（T）、以试验组为测试品（C）计：（C-Co）/T > 70%细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测结果统计批号培养基名称菌种培养时间（h）菌液组菌数Cfu试验组菌数Cfu供试品对照组菌数回收率%数值平均数值平均数值平均150804营养琼脂培养基枯草芽抱杆菌7284869092.581095.9728895金黄色葡萄球菌7286849391.597.072829012大肠埃布困728485.5919295.9728793玫瑰红钠培养基枯草芽抱杆菌1208

15、686.584850098.31208786金黄色葡萄球菌1208787.5858698.312088870大肠埃布困1208785.5838397.11208483150805营养琼脂培养基枯草芽抱杆菌7288859592.56597.1728690金黄色葡萄球菌728584.59593.595.57284924大肠埃布困728184.58991.597.7728794玫瑰红钠培养基枯草芽抱杆菌12083858787.50097.11208788金黄色葡萄球菌12086848886.597.112082850大肠埃布困1208884868895.51208090150806营养琼脂培养基枯草

16、芽抱杆菌728785.59495.56695.5728497金黄色葡萄球菌728386969695.67289966大肠埃布困728585.5959695.0728697玫瑰红钠培养基枯草芽抱杆菌120848485870096.61208489金黄色葡萄球菌1208585.5908996.112086880大肠埃布困1208283.5898796.01208585通过连续三批次不同种菌类的加样，回收率均在90%以上，说明本产品对于细菌、霉菌及酵母菌不具备抑菌性。3.2控制菌3.2.1大肠埃希菌取10 ml供试液(制备方法同3.1.1)及大肠埃希菌菌悬液1ml(10100cfu)加入胆盐 乳糖培

17、养基100ml，于35C培养24小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养 基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培 养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。紫外灯照射时管内培养 物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性；加入靛基质试液时液面呈玫瑰 红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。322沙门氏菌取10 ml供试液（制备方法同3.1.1）及乙型副伤寒沙门菌1ml（10100cfu）,直接接 种至200ml的营养肉汤培 养基中，混匀，于35°C培养培养24小时，取上述培养物1ml， 接种于

18、10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，35C培养24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼 脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上，35C培养24小时。3.3合格标准若上述试验检测出试验菌，则按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行供试品的 该控制菌检查。控制菌抑菌性检查大肠埃布困试验组（+/-）阴性对照组（+/-）MUG+ +- -靛基质+ +- -沙门氏菌试验组（+/-）阴性对照组（+/-）四硫磺酸钠亮绿培养基+ +- -胆盐硫乳琼脂培养基+ +- -曙红亚甲监琼脂对照培养基+ +- -三糖铁琼脂对照培养基+ +- -经控制菌的验证，当样品被1:10稀释时，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿法进 行检验而不对检测结果造成假阴性的影响。五、本品微生物限度检查方法的确定综上所述，本品细菌、霉菌及酵母菌检查采用常规平皿法，取1: