石蜡包埋组织的dna提取及其应用

1、石蜡包埋组织的DNA提取及其应用近io年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺 失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的开展与转归等方面均具有重要意义。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片 上进行原位杂交或原位 PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子

2、生物学技术，本 节 不再赘述。Goelz1985和Dubeau等1986 成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了 DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回忆性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方 面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织 DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。一、石蜡包埋组织DNA提取的根本方法从石蜡包埋组织中提取 DNA的根本步骤，是在常规 DNA提取方法的根底上改进和演变而来。Goelz等1985 最先提出的石蜡包埋组织 DNA提取技术表18-5 ，是用机械

3、的方法破碎组织，切除多余的 石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K 1mg/ml 的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等1986 在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使 细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂 交的降解的DNA小片段去除，仅保存那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了 DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等1990 对上述两种方法进行了比拟，

4、发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤1.切除多余石蜡，暴露组织2 .将组织切碎最大径 <0.5mm ，称重；3 .溶于TE9提取液组织<50mg/5ml,50500mg/10ml ，高速混悬23min ;于48。放置24h，其制备 见表18-6 ;4 .再次混悬组织，参加蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h ;5 用等体积酚-氯仿溶液抽提3次；6. 2.5倍体积乙醇沉淀DNA7. -70 C放置24h8 . 9000 Xg 离心 1h9 .沉淀物用70%乙醇洗1次10 .枯燥，T

5、E pH7.2 溶解.表18-6 TE9 DNA提取液的制备500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmoo/LNaCl1%SDS500 g g/ml蛋白酶KPH8.05 gm组织切片常规脱蜡、水化第一次溶液A孵育去上清第二次溶液A孵育留上清氯仿-异戊醇抽提RNA酶和蛋白酶消化酚抽提沉淀(却除未螺旋化DNA ) J透析图18-6 石蜡包埋组织 DNA提取流程(Drbeau等，1986)溶液A2XSSC100卩g蛋白酶K/ml1% SDS不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要1015 大片段DNA (> 20kb )，因为杂交前要进行

6、相应的限制性内切酶消化和凝胶别离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段 DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反响(PCR )那么可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的 DNA很少，0.5甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法(Sle - bos,et al, 1990 ; Smit, et al. 1988 )、蛋白酶消化法(Impraim et al. 1987 ; Brice, et al. 1989)。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤， 直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓

7、冲液中消化4h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行 PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。、影响DNA提取质量的因素1固定剂对 DNA 的影响固定剂的类型直接影响提取 DNA 的质量。目前大多数实验室常用的中性缓 冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Warford等1988 对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反响性可分为两个阶段：早期出现碱基快速可逆

8、性羟甲基化； 数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶 K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的 DNA 某些理化性质改变。bramwell等1988 发现，甲醛和戊二醛固定可使得 DNA产量降低，醋酸甲醇MAA 可导致DN A明显降解。Michel '运输保存液或PBS存放组织虽提取 DNA纯度高，但产量明显降低。Dubeau等也观 察到含苦味酸 Bouin 氏液和含氯化汞的固定液 Zenker,Bs 处理标本不能获得完整的 DNA。乙醇被认为是保存核酸的最正确固定剂。Wu等1990 用无水乙醇固定标本 48h，最长达2年，均可得到中

9、量的高分子 DNA。每mm3乙醇固定标本平均 DNA产量为26.6屈高于新鲜标本19.4 g/mm3。 经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织 DNA 均显示由于重复 DNA 序列存在所产生的特征性卫星带，说明 DNA 被完成消化。 Southern 印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato等1990 用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无损。其根本方法为：将组织放至 4 'C丙酮浸透，移至-20'C过夜。然而再用丙酮分别在 4 °和室温脱水各15min， 苯甲酸透明两次，每次 15min，最后60 C真空浸蜡2 3h，石蜡包埋。结果显示，每

10、 10mg AMex法处理 的湿重组织提高分子量 DNA71.4± 14.53 gg，与新鲜组织产量相当70.4 ±13.76 gg。酶切、电泳和杂交反 应亦相同于新鲜组织。提示 AMex 法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于 DNA 降解、高分子量 DN A 减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA 保存方法，特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。2固定时间对 DNA 的影响固定过程中所发生的组织反响至今尚未被完全更理解，虽然理论上讲室温 下福尔马林与 DNA 几乎不发生反响， 但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。 这种福尔马林介导

11、的甲基化 直接影响 DNA 提取的效率。如果事实果真如此，那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而，Goelz 等没有发现固定时间对 DNA 提取质量的明显影响。 Dubeau 等认为组织固定时间太短或太长均会导致 DNA 的降解。该作者对固定 12h 到 5天不同时间间隔标本的 DNA 提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化 Spoolable 的高分子量 DNA 明显减少。固定 5 天后可螺旋化 DNA 提取率仅有 8%。 Warford 等也发现 单细胞悬液经 30min 福尔马林固定后， DNA 产量减少到 30% ，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的 最正确固定时间应摸索选定。根据

12、 Dubeau 等经验，常规组织固定应在 12h 以上至 110 之内。3固定温度等其他因素对 DNA 的影响核酸与固定剂的反响由反响成分、浓度、酸硷度以及温度等因 素的调节 ，其中温度效应显得特别重要。 室温下 DNA 双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷 酸；加热到65 C时，氢键开始断裂；约 90°时，产生两条单链分子。在此变性状态下，甲醛与酸反响很快， 通过羟甲基化作用可抑制 DNA 冷却后的再复性。最近， Koshiba 等发现福尔马林固定过程中的 DNA 降解，是由于固定温度高， pH 低以及甲酸的存在 所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定4C，可以明显改善 D

13、NA保存。酸性环境中 DNA 的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致 DNA 的完全解聚，而弱酸也能引 起一些结构的改变。当 pH 到达 2.5 以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离，使 DNA 双链断裂而产生不可 逆的变性；随后出现 N-糖苷键水解，使嘌吟残基游离；最后，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完 整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。参加盐或降低温度可稳定氢键，因而 可防止酸性条件下的 DNA 变性。然而，即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下 DNA 亦发生降解，提示 福尔马林本身即可降解 DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。4

14、组织处理过程对 DNA 的影响我们发现， 从常规组织处理的蜡块中提取的 DNA ，其大局部分子量在 100bplOOObp之间，主要分布于1001500bp，仅约1/3的组织所提取 DNA>20kb。这除与固定剂、固 定时间等因素有关外，可能的原因还有：组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。当组织未固定或 固定不充分时，核酸酶可自由作用；不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；蜡块贮存的时间长短不一。 虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的 DNA 大小无绝对区别， 但新近的蜡块比 贮存 10 年以上的标本所获得的 DNA 分子量大。可能蜡块中仍存在导致 DNA 降解的因

15、素。组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致 DNA 变性，而产生单链 DNA 片段。单链 DNA 不 能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。三、提高 DNA 提取质量的方法1蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA 的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在 DNA 提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出 血等改变的蜡块不能用；假设有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死局部切去后再用。尽可能地选用新 近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最正确。2DNA 提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA 提取的质量和效益， 人们

16、从不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改进，蛋白酶的消化时间和 DNA纯化等问题上取得了进展。 DNA提取液主要 含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DAN与蛋白质不易别离。因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1%2%，蛋白酶K200500gg/ml，最 高可达1mg/ml ;作用时间一般为24天，最长可达7天。蛋白酶K可分次参加，并注意不时震摇，使酶 与组织充分接触。 Koshiba 等发现， 利用 Goelz 等和 Dubeau 等提出的 DNA 提取方法， 不能够得到令人满 意的完整DNA。尿素和胍guanidine 是DNA自

17、然和人工交联最有力的剥脱剂，2-巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对 DNA 提取液进行了改进，参加高浓度 4mol/L 尿素和 2-巯基乙醇。应用此 缓冲液，有效地从包埋组织中获得高质量DNA。DNA释放率对于不同的组织类型是有差异的，取决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织例如脾脏，通过24h 孵育 80%以上 DNA 可释放出来；相同量的 DNA 释放对于富含致密间质的子宫肌瘤那么需要 6 天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质， DNA 释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织 DNA 提取，蛋 白酶K的孵育时间可作适当调整，以求最大量地获

18、取大分子DNA。此外，对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化 和杂交不起作用。Dubeau等发现，不适于进行酶切反响和杂交研究的化学修饰的DNA，可通过搅起完整的 DNA 而被动除去，因而强调了螺旋化( spooling )在 DNA 纯化中的重要性。该作者还发现延长组织 固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化 DNA 的量，杂交分析显示，螺旋化 DNA 杂交信号强，而未螺旋 化 DNA 信号减弱。因此，增加 DNA 螺旋化可提高提取 DNA 质量和杂交效率。但是， Moerkert 等认为未 螺旋化 DNA

19、不影响进行点杂交分析。3防止 DNA 机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难到达匀浆的效果。经常的做法是将组织切成35薄片，使每一细胞都被切开。但是，我们认为切片太薄，容易过多地将DNA切断， 影响高分子量DNA的获得率。最好是采用1520gm的厚切片。高浓度蛋白酶K消化24天，使能到达 细胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并尽可能防止机械性匀浆过程造成的DNA 剪切。此外， 在 NDA 释放出来以后的提取过程中， 应尽可能轻柔操作， 防止过多地移管。假设必需移管时应选 用大口吸管。尽可能防止人为的 DNA剪切。纯化DNA用TE (pH8.0 )溶解放4。保存即可，假设短期不用 时

20、应-20。冻存，但切忌反复冻融，以免 DNA降解。四、石蜡包埋组织 DNA 分析的方法学由于 DNA 提取方法的改善和 DNA 质量的提高，几乎所有基因分析的技术均可用于石蜡包埋组织，但 目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、 Southern 印迹杂交和多聚酶链反响( PCR )。1 点杂交 鉴于包埋组织 DNA 有一定程度的降解，因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的 方法，特别适用于较大样本的筛选。Dyall - smith等(1988 )采用未经抽提的蛋白酶消化产物直接点膜，进行点杂交分析，在 3 周内对 200 多病例进行筛选，对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点，再进行原位杂 交等方

21、法作进一步证实。2Southern 印迹杂交 Southern 印迹杂交是经典的基因分析技术，已被广泛地用于基因突变，扩增、 重排和丧失等许多方面的研究。石蜡包埋组织的 Southern 印迹杂交分析有以下几个方面值得注意：(1 )当所分析的酶切片段长为 300500bp时，包埋组织DNA杂交信号强度只有相同量标准 DNA 的10%85%。信号强度与原始 DNA大小呈正相关，最小片段 DNA产生最弱的信号。(2) 包埋组织 DNA 所致的非特异性背景杂交比标准DNA 为明显。这种背景杂交的产生可能是由于不包含到分析基因中两个限制性内切酶识别位点的小片段DNA 存在。(3) 由于背景杂交明显使得

22、信号模糊，信/噪比缩小。根据 Goelz 的经验，约有 25%石蜡包埋组织不 适于作 Southern 印迹杂交。4 某些限制性酶切片段的电泳速度比标准 DNA 稍缓慢。可能的原因是 DNA 直接或间接的化学改 变使某些限制性酶切位点失活和 /或单链 DNA 存在。5 由于小片段 DNA 的存在，故用作杂交分析的 DNA 量应适当增加，以增强杂交信号。3PCR 分析 PCR 技术是近年来分子生物学技术的典范， 已被广泛地用于分子病理学的各个领域。 此 技术不但特异性好和敏感性高，而且简便、快速、模板 DNA 要求不高，特别适于石蜡包埋 DNA 的分析。用于 PCR 扩增的 DNA 提取比拟简单

23、， 既使少量 DNA 样品亦能产生大量特异性 DNA 拷贝。 已被成功 地用于各代木乃伊 DNA的分析，小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可获得满意的扩增，并可用于 诊断。但是，为了提高 PCR 的敏感性和可重复性，模板 DNA 应尽可能地纯化，除去提取物中某些抑制 P CR 反响的成份。此外，切片过程中要注意防止污染，以免出现假阳性。最近， Davis 等 1 993 对 PCR 产物进行单链构型多态性 SSCP 分析，可以提高 PCR 敏感性 5 倍以上。SSCP分析是应用单链DNA在非变性聚丙酰胺凝胶上电泳，根据序列的不同所产生的构型差异来 分析 PCr 产物。此分析能检测出小到一

24、个碱基的差异，因而可被广泛地用于研究点突变和基因多态性。此外，在包埋组织的DNA提取中往往发现有 RNA的存在。这些未加任何保护而免受降解的 RNA，不 可能是完整的序列。 然而， 此发现提示用福尔马林固定的组织亦可作为 Northern 印迹杂交分析的可能材料 来源。五、分子病理学研究中的应用1基因重排分析与淋巴瘤的诊断分子生物学技术在肿瘤诊断中的应用，目前仅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特异性抗原受体基因重排的单一性细胞增殖为特征。因此，克隆性免疫球蛋白lg和T-细胞受体TCR基因重排的检出可作为淋巴瘤诊断的重要指标，这在国外许多实验室已成为常规诊断技术。Southern 印迹杂交和 P

25、CR 都已被成功地用于基因重排分析。此技术在以下病变的诊断和鉴别诊断中特别有意义：恶性淋巴瘤与反响性淋巴组织增生的鉴别。后者为多克隆性细胞增生，不能检出或扩增出克隆性基因重排序列；T和B细胞性肿瘤的区分：PCR3基因重排支持T细胞源性，而lg重链基因那么为 B 细胞源性。然而，一局部病例显示 lg 和 TCR 基因双重排。在这种情况下，要结合其他基因分析。假设同 时伴有lg轻链K或人基因重排那么支持B细胞肿瘤；同时伴有TCRr或TCRs基因重排那么为T细胞肿瘤。 另外，也可结合免疫分型。双基因重排的肿瘤往往一种基因为不完全重排、不伴有相应的抗原受体表达， 故免疫表型上往往是单一的。 T细胞性淋

26、巴瘤的诊断，T细胞肿瘤形态变化多端、免疫表型上无克隆性 标记，故对此类淋巴瘤均有必要进行基因分型。T细胞优势性B细胞淋巴瘤。这种肿瘤在形态和免疫表型上很难建立诊断。残留病变监测和复发的早期诊断。此技术还可用于识别骨髓的累及、治疗或骨髓移 植后剩余病变的检测，以及形态学上不能发觉的早期复发的诊断。</P< p>某些淋巴瘤 /白血病所伴有的特异性染色体易位是另一种类型的基因重排标记。例如滤泡型淋巴瘤中常出现的t (14 : 18)易位，Burkitt氏淋巴瘤的t ( 8 : 14八t (8 : 2 )和仁8 : 22)易位，以及慢粒或急淋白血 病中常见的 t( 9： 33)易位。

27、因上述基因重排在淋巴瘤中出现频率不高，故诊断应用价值不大。2癌基因与抗癌基因的研究分子生物学在肿瘤病理学中另一热点是癌基因和抗癌基因的研究。自从1981 年 Weinberg 等首先报道人癌基因别离成功以来， 至今已有 50 多种癌基因被发现， 这些基因普遍存在 于各种生物细胞中，对于细胞的生长和分化起着重要作用。在正常情况下，其表达受到严风格控；病理状 态下，癌基因活化，表达失控，使细胞原有的正常生物学性状发生改变，从而导致细胞癌变。据报道，癌 基因的结构和功能改变见于造血系统、乳腺、粘膜鳞状上皮、前列腺、肺、肾、消化道、膀胱、卵巢、消 化腺、神经系统和软组织等肿瘤。另一类基因称抗癌基因或抑

28、癌基因，现已发现的有p53、Rb、DCC、W和NF!等。其蛋白产物的功能是阻滞癌基因所编码多肽的活性。因此，如果抗癌基因发生突变或功能丧失，异常的癌基因产物表达失 控，而诱发细胞转化为肿瘤。此现象为见于视网膜母细胞瘤、子宫内膜、结肠、食管等各部位的肿瘤。目前，对人类肿瘤中癌基因和抗癌基因的检测，已经在肿瘤的分类、发病机理、肿瘤生物学行为和预 后的关系等方面与肿瘤临床密切结合起来，并正在逐渐地应用于肿瘤的诊断、鉴别诊断和治疗。( 1)癌变机理的研究:癌基因活化和抗癌基因失活在人类肿瘤的发生开展过程中起重要作用。已有大 量证据说明，至少需要两种以上的癌基因活化的协同作用才能使正常细胞发生恶性转化。

29、目前研究发现绝 大多数肿瘤有一种以上的癌基因过度表达，一种癌基因对靶细胞的永生化起重要作用，而另一种那么促进细 胞的永生化。(2) 肿瘤生物学待业和预后的研究:某些癌基因突变及其产物的过度表达与癌细胞的分化和恶性程度有关。目前研究最多的是 c -jrbB - 2与乳腺癌的关系。许良中等(1992 )发现，浸润性导管癌中 c - e rbB - 2阳性表达率达67%以上，单纯癌阳性率为26.5%，而全部乳癌良性病变皆阴性。我们的研究发现，c -erbB 过度表达的乳腺癌预后不良，Schimmelpenning 等(1992 )也报告伴有c -erbB 扩增的导管内癌易于发生周围浸润。此外， ra

30、s P21 在乳腺癌中的表达也有上述趋势。(3) 辅助诊断和鉴别诊断: bc1-2 基因已被用于滤泡型淋巴瘤与反响性滤泡增生的鉴别诊断，前者阳 性表达率在 80% 以上，而后者几乎为阴性； ras 癌基因突变或过度表达有助于甲状腺乳头状癌、乳腺导管 癌、结肠腺癌等肿瘤的诊断；小细胞肺癌常伴有n - myc突变。(4) 癌细胞的组织发生：paget氏病可分乳腺外(EPD )和乳腺内(MPD )两种。有关paget细胞 的起源问题仍有争议。 许良中(1993 )观察了 c -erbB - 2和p53在77例EPD和10例MPD中的表达， 认为 MPD 中的 paget 细胞是来源于腺癌细胞而不是表皮的角质层细胞。 EPP 中的 paget 细胞也来源于腺 癌细胞，但这种腺癌细胞与 MPD 中的腺癌细胞不