色谱技术简介

1、色谱技术简介发布者：杭州科晓化工仪器设备发布时间：2007年1月30日0 Audo Iook6.0 下载引言色谱法是1906年俄国植物学家 Michael Tswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，企图别离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。别离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法Chromatography ，又称层析法。其后的一个重大进展是1941年Martin和Synge发现了液液分配色谱法 Liquid-Lipuid partition Chromatography，简称LIC。他们用覆盖于吸 附剂外表的并与流

2、动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。试样组分按照其溶解在两相之间分配。Marti n和Synge因为这一工作而荣获1952年诺贝尔化学奖。在使用柱色谱的早期年代，可靠地鉴定小量的被别离物质是困难的，所以研究开展了纸色谱法Pap er Chromatography，简称PC。在这种"平面的技术中，别离主要是通过滤纸上的分配来实现的。然后由于充分考虑了平面色谱法的优点而开展了薄层色谱法Thin-Layer Chromatography，简称TLC,在这种方法中，别离系在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。在Stah l于1958年进行了经典性的工作将技术和所用材料加

3、以标准化之后，薄层色谱法方赢得了声誉。为了帮助提高纸色谱法或薄层色谱法对离子化合物的别离效率，可以向纸或板施加电场。这种改良了方法分别称作纸上电泳或薄层电泳。新近开展起来的色谱法气相色谱法是 Martin和James于1952年首先描述的，现已成为所有色谱法中最高级和最广泛使用的一种方法，它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体，即便对于很复杂的混合物，其别离时间也仅为几分钟左右，这已 属司空见惯。高分辩率、分析迅速和检测灵敏等几种优点之综合使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种 常规方法。近年来，因为新型液相色谱仪和新型柱填料的开展以及对色谱理论的更深入了解，又重新引起对密闭柱液相色

4、谱法的兴趣。高效 液相色谱 法High-Peformanee Liquid Chromatography ，简称HPLC迅速成为与气相色谱法 一样广泛使用的方法，对于迅速别离非挥发性的或热不稳定的试样来说，高效液相色谱法常常是更可取的。色谱法分类色谱法有多种类型，也有多种分类方法。一按两相所处的状态分类液体作为流动相，称为" 液相色谱liquid ehromatograp-hy ;用气体作为流动相，称为"气相色谱gasehromatogr-aphy 。固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相，所以层析法按两相所处的状态可以分为：液液色谱(

5、liquid-liquid chromatography)气固色谱( gas-solid chromatography)气液色谱 gas-liquid chromatography二按层析过程的机理分类)吸附层析( adsorption chromatography利用吸附剂外表对不同组分吸附性能的差异，到达别离鉴定的目的。分配层析 partition chromatography 利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数 或溶解度不同， 而使之别离的方法。离子交换层析 ion-exchange chromatography 利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行别离的 方法。凝胶层析

6、 gelchromatography 利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行别离 的技术。三按操作形式不同分类柱层析 colum chromatography 将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而到达别离。纸层析 paper chrmatography 用滤纸作液体的载体担体 support ，点样后，用流动相展开，以到达别离鉴定的目的。薄层层析 thin layper chromatography将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的别离和鉴定。吸附色谱法吸附色谱法常叫做液固色谱法 Liquid-SolidChromatography，简称LS

7、C,它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用。可以将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。吸附剂是具有大外表积的活性多孔固体，例如硅胶、 氧化铝和活性炭等。活性点位例如硅胶的外表硅烷醇，一般与待别离化合物的极性官能团相互作用。分子的非极性部 分例如烃对别离只有较小影响，所以液固色谱法十分适于别离不同种类的化合物例如，别离醇类与芳香烃。分配色谱法 在分配色谱法也称体液液色谱法中，溶质分子在两种不相混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。固定相均匀地覆盖于惰性载体一多孔的或非多孔的固体细粒或多孔纸上纸上谱。为防止 两相的混合，两种分配液体在极

8、性上必须显著不同。假设固定液是极性的例如乙二醇，流动相是非极性的例如乙 烷，那么极性组分将较强烈的被保存。这是通常的操作方式。另一方面，假设固定相是非极性的例如癸烷，流动 相是极性的例如水，那么极性组分易分配于流动相，从而洗脱得较快。后一种方法它有相反的极性称作为反相 液一液色谱法。由于溶解度差异的细微效应，所以液一液色谱法很适于别离同系物的同分异构体。在液一液色谱法中， 固定相几乎都被化学键合在载体物质上，而不是机械覆盖在它的外表。这种色谱法称作键合相色谱法Bonded-PhaseChromatography，简称BPC。这种方法的机理尚不清楚，可能是分配机理，也可能是吸附机理，视实验条件而

9、定。高效 液相色谱 法中，键合相色谱法的应用远远超过所有其他模式。离子交换色谱法Sober 和 Peterson 于 1956 年首次将离子交换基团结合到纤维素上， 制成了离子交换纤维素， 成功地应用于 蛋白质的别离。从此使生物大分子的分级别离方法取得了迅速的开展。离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖S-ephadex和琼脂糖凝胶Sepharose 上。近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的别离和纯化。它们的优点是：具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。具有亲水性，对大 分子的吸附不大牢固，用温和条件使

10、可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。多孔性，外表积大、交换容量大， 回收率高，可用于别离和制备。一、根本理论离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离 的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反响都是平衡反响，但在层析 柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子 全部洗脱下来，同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐减少，因此也可以全部 被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱

11、时，在被洗脱的能力那么决 定于各自洗反响的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段一一吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可 以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而到达解离但更多的是通过增加离子强度，使参加的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力 大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，到达别离纯化的目的。二、离子交换的分类及常见种类一分类 离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小，还可分为强、弱两种，即 强酸剂 阳离子交换剂弱酸剂

12、强硷型 阴离子交换剂 弱硷型 。1. 阳离子交换剂阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸-S03H、磷酸-PO3H2、 羧酸COOH和酚羟基-0H等酸性基。某些交换剂在交换时反响如下：强酸性： R-SO3 -H+ Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性： R-COOHNa+ R-COONaH+国产树脂中强酸1X 7 上海树脂# 732和国外产品 Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。2. 阴离子交换剂阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、-NH2、仲胺-NHCH3、叔胺N- CH3 2和季胺-N CH32 等硷性基团。某些交换反响如下：强硷性：R-N+ CH3 2 H OH-

13、+ Cl R-N+ CH3 2 Cl + OH-弱硷性：R-N+ CH3 2 H OH- + Cl R-N+ CH3 2 HCl + OH-强硷性 201 号国产树脂和国外 Dowex1、 Dowex2、 ZerolitFF 等都属于强硷型阴离子交换剂。二 种类1. 纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素CM纤维素，阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱DESE纤维素。因而既具有离子交换作用，2. 交联葡聚糖离子交换剂： 是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱别离物质。常用的Sephadex 离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有

14、DEAE-SephadexA-25 ， A-50 和 QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 阳离子交换剂有 CM-SephaetxC-50 ， C-50 和 SephadexC-25 , C-50。阴离子交换剂用英文字头A,阳离子交换剂的英文字头是G英文字后面的数字表示 Sephadex型号。3. 琼脂糖离子离交换剂：是将 DESE或CM基团附着在 Sepharose CL-6B上形成，DEAE-Sephades 阴离子和 CM-Sepharose邙日离子，具有硬度大， 性质稳定，凝胶后的流速好，别离能力强等优点。三、实验操作一交换剂的处理，再生与转型 新出厂的树脂是干树脂，要用

15、水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：新出厂干树脂用水浸泡 2 小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量 2N HCl 搅抖 4 小时，除去酸液，水洗到中性，再加 4 倍量 2NNaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+,那么用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带 H+,可用HCI处理。阴树脂转型也同样，假设希望带Cl-那么用HCI，希望带OH-那么用NaOH用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了

16、。二柱上操作交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保 持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。上样向层析柱内倾入样品液洗脱与收集 不同样品选用的洗脱液不同。原那么是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着 的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单 一物质。胶色谱法 凝胶色谱技术是六十年代初开展起来的一种快速而又简单的别离分技术，由于设备简单、操作方便，不 需要有机溶剂，对高分子物质有很高的别离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分

17、子免疫学以及 医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。一、根本理论一分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂 直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所 以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进 入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散， 小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分

18、子的后流出，分子最小的最 后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限 和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻 的分子即使大小不同，也不能有别离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都 能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差异，也不会有好的别离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。 综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入 凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙

19、中孔径大小相应的局部。大、中、小三类分子彼此间较 易分开，但每种凝胶别离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难别离的。对于分子大小不同，但同属于 凝胶别离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一局部凝胶孔隙内， 而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子 较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质别离。另外，凝胶本身具 有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多 种成份在通过凝胶床时，按照分子

20、量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。二色谱柱的重要参数柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积外表的体积。在色谱柱中充满凝胶的局部称为凝 胶床，因引柱体积又称“床体积，常用 Vt表示。外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这局部体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内 水体积，又称定相体积，常用 Vi 表示。不包括固体支持物的体积 Vg。峰洗脱体积：是指被别离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve表示。当使用样品的体积很少时，与洗脱体积比拟可以忽略不计，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用 洗脱液体

21、积为 Ve。当样品体积与洗脱体积比拟不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点或半高处。二、凝胶的种类及性质一交联葡聚糖凝胶 Sephadex SephadexG交联葡聚糖的商品名为 Sephndex,不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的 10 倍。例如， G-25 为每克凝胶膨胀时吸水 2.5 克，同样 G-200 克每克千胶吸水 20 克。交联葡聚糖凝胶的种类 有G-10，G-15，G-25, G-50，G-75, G-100, G-150，和G-200。因此，“ G'反

22、映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部 范围。Sephadex LH-20 ,是一Sephadex G25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于别离不溶于水的物质。二琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose 瑞典，Pharmacia ， Bio-Gel-A 美国Bio-Rad 等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳 定的，可以在许多条件下使用如水，pH4-9范围内的盐溶液。琼脂糖凝胶在40C以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。三聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯

23、酰胺交联成的，经枯燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶-PBio-Gel P ，由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从 P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。四聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ,具有大网孔结构，可用于别离分子量1600到40, 000, 000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的 分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。三、实验技术一层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响别离度，样品用量

24、大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。别离度取决于柱高，为别离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，别离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族别离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比拟5:1 10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级别离时柱高与直径之线为20:1 100:1，常用凝胶柱有 50X 25厘米，10X 25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被别离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影

25、响洗脱峰形， 出现拖尾出象，降低分辩力。在精确别离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。二凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为 20, 1克SephadexG-200吸水后形成的凝胶体积约 40ml。凝胶的粒度也可影响层析别离效果。粒度细胞别离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室别离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50 ,用粗粒，短柱，流速快。三凝胶的制备商品凝胶是枯燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加

26、速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，Sephadex自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除 去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。四样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过G-15 短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4 ，粘度高影响别离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的别离要求确定。别离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4 一般约 0.5-2ml ，进行分族别离时样品液可为凝胶床的 10，在蛋白质溶液除盐时，样品可

27、达凝胶床的20-30 。分级别离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。五防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重 要，常用的抑菌剂有 :叠氨钠NaN3在凝胶层析中只要用 0.02 %叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20C时约为 40；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层 析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。可乐酮 Cl3C-COHCH32 在凝胶层析中使用浓度为 0.01-0.02 %。在微酸性溶液中它的杀菌效果最正确， 在强碱性溶液中或温度高于60 C时易引起分

28、解而失效。乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中最为有效。 重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为 0.001-0.01 %。在微碱性溶液中抑效果最正确， 长时间放置时可与卤素、 硝酸根离子作用而产生沉淀；复原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。亲和色谱法一、根本理论一原理在生物体内，许多大分子 AKSJDHFKLSDFHKLS具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的D

29、NA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结 合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶 性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的根本过程是：1. 配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱称亲和性。2. 亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。3. 解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在

30、亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。二应用范围亲和色谱可用于以下生物体系：酶：底物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞外表受体、细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白激素及维生素：受体、载体蛋白细胞：细胞外表特异蛋白、外源凝集素 亲和色谱的优点是操作简便、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。三载体的选择原那么用于亲和色谱的理想载体应具有以下特性：不溶性：不溶于水；渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；有一定硬度，最好为均一的珠状；具有大量可供反响的化学基团，能与大量配基共价连接；非特异性 吸附能力极低；能抗微生物和酶的侵蚀；有较好的化学稳定性；亲水

31、性。选择配基根据对纯化大分子的特异性 的全面认识。选择也的配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基；相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质一一配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素抗生物素蛋白复合物的解离常数达10-15M,解离时需要pH1.5, 6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。选择配基的第二个标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但 可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。四常见载体的特性琼脂糖凝胶

32、： 亲水性强，理化性质稳定 商品名： Sepharose 聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比拟弱的物质。葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。纤维素： 非特易吸附严重，廉价，易得。二、实验方法亲和色谱别离的方法随每种别离物质的不同而有不同。一般推荐使用的程序如下：1 选 择 配 基； 2选择偶联凝胶； 3偶 联 配 基； 4装填适宜的柱； 5平衡2-3 倍体积缓冲液 ； 6应 用 样 品；7洗涤未结合物质；8洗脱结合物质t除盐；9再生高压 液相色谱Martin 和Synge 在 1941 年就提出高效相色谱的设想， 然而

33、直到六十年代后期， 由于各种技术的开展， 高效 液相色谱 才 付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱 HighSpeedLiquid Chromatography ，高压 液相色谱 High Parss-ure Lipuid Chromatography，目前使用最多的名称是高效 液相色谱 High Pe-rformance LiauidChromatography , HPLC。高效液相色谱已经广泛地应用，成为一项不可缺少的技术。它的主要优点是分 辩率高于其它色谱法；速度快，十几分钟到几十分钟可完成；重复性高；高效相色谱柱可反复使用；自动化 操作，分析精确度高。根据别离过程中溶质分子与固

34、定相相互作用的差异，高效液相色谱 可分为四个根本类型，即液固色谱、液液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效 液相色谱 在生物领域中广泛用于以下产物的别离和鉴定： 氨基酸及其衍生物；有机酸；甾体化合物；生物硷；抗菌素；糖类；卟啉；核酸及其降解产物；9 蛋白质、酶和多肽；脂、分类高效 液相色谱 法可分为四个根本类型：即液固色谱法，键合相色谱法，离子交换色谱法及体积排阻色谱法。一液固色谱法 液固色谱法通常称吸附色谱法，吸附剂有活性碳，氧化铝和硅胶，在液固色谱法中用的载体都是硅 胶。硅胶对溶质，分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱外表的，在硅胶外表有一些区域与溶质分子强烈相互作用， 这些区域为活性位

35、置，硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用。极性越强，而化合物在硅胶柱上 的滞留时间也长。在液固色谱中，依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置，从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶外表活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强，因而称强溶剂，反之为弱溶剂。液一固色谱法的特点是适于别离色谱几何异构体，可用于脂溶性化合物质如磷脂，甾体化合物， 脂溶性维生素，前列腺素等。二键合相色谱法 键合相色谱法是由液液色谱法即分配色谱开展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒 上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱

36、柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。1. 正常相色谱法在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二 氨基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性， 因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液固色 谱法相同，称这种色谱法为正常相色谱法。尽管如此，正常相色谱法的别离原理主要根据化合物在固定相及流动相中 分配系数的不同进行别离，它不适于别离几何异构体。2. 反相色谱法在反相色谱法中共价结合到载体上的固定相是一些直链

37、碳氢化合物，如正辛基等。流动相的极性比固定 相的极性强。反相色谱法在高效 液相色谱 法中应用最广泛。在反相色谱法中，使溶质滞留的主要作用是疏水作用，在高效 液相色谱 中又被称为疏溶剂作用。所谓疏水作 用即当水中存在非极性溶质时，溶质分子之间的相互作用、溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用，因此溶质分子从水中被“挤了出去。可见反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去，在色 谱柱中滞留时间也长，所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到别离。反相色谱法适于别离带有不同 疏水基团的化合物，亦即非极性基团的化合物。此外，反相色谱法可用于别离带有不同极性基团的化合物

38、。可以通过 改变流动相的溶剂及其组成和 pH,以影响溶质分子与流动相的相互作用，改变它们的滞留行为。另外，反相色谱中水 的流动相中占的比例伸缩性很大，可以从 0-100，从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的别离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和和烷烃,其链的长短不同,最长的是十八烷基,这也是使用得最 多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱中溶质由于疏水作用而滞留的时间也将 随着碳氢链的长度而增加。在一般情况下这意味着用碳氢链长的反相色谱柱能得到较好的分辩率,在多数情况下是依 靠反复来选择色谱柱。由于反相色谱法的固定相是疏水的碳氢化合物,溶质与固定相之间的作用主要是非极性相互作 用,或者说疏水相互作用,因此