正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆

1、正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆【摘要】目的取得骨形态发生蛋白（BMP9）基因并进行基因读码框架的克隆。方式自正常成人肝组织提取总RNA,一步法RTPCR扩增BMP9,扩增产物通过胶回收及酶切后，克隆入高效真核表达质粒pcDXA4/HisMax,构建重组表达载体。结果RTPCR扩增取得约kb大小的产物，经限制性酶切分析和DNA测序，证明为人BMP9基因的完整开放读码框架。重组载体表达读码序列正确。结论正常成人肝组织总RXA经一步法RTPCR,能够对BMP9基因的开放读码框架进行完整有效的挑选。BMP9开放读码框架的完整克隆为其在骨、内分泌和神经系统等多能作用的转基因实验研究提供了基础。【

2、关键词】骨形态发生蛋白质类重组真核表达载体逆转录聚合酶链反映ABSTRACTObjectiveTocloneBMP9geneinadultlivertissueandconstructrecombinanteukaryoticexpressionRNAwasextractedfromnormallivertissueofanadult,thenopenreadingframeofBMP9wasclonedbyonestepRTPCR.ThePCRproductskb）wereinsertedintoeukaryoticexpressionvector,pcDNA4/HisMax,toconst

3、ructrecombinanttorestrictiveanalysisandDNAsequencingofrecombinantvector,theopenreadingframeofBMP9wasidentifiedandtheinsertinMCSwasORFofBMP9genecanbescreenedeffectivelyfromtotalRNAofnormallivertissuebyonestepRTPCR.ThecompletecloneofORFofBMP9hasprovidedthebasisformultifunctiongenetransferexperimentsin

4、thefieldsoforthopedics,endocrinologyandcentralnervoussystem.KEYWORDSbonemorphogeneticproteins;recombinanteukaryoticexpressionvector;reversetranscriptasepolymerasechainreaction转化生长因子8(TGF13)超家族在细胞生长和分化中具有重要作用。TGF8超家族中的一个特殊亚族由骨形态发生蛋白(BMPs)组成。这些二聚体蛋白的特性是在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力1。目前在BMP亚家族中己发觉40个以上成员，不同的BMP分子

5、通过I、H型受体在哺乳类动物体内的不同系统发挥生理作用2。BMP9是BMPs亚家族的成员之一，人BMP9基因位于染色体，其成熟肽段包括110个氨基酸。除具有成骨活性之外，BMP9还具有参与肝的糖代谢、阻碍神经系统胆碱合成和对造血干细胞双向调剂的作用等。本研究利用逆转录聚合酶链反映(RTPCR)技术挑选BMP9的全长读码框架，克隆入真核表达载体构建重组体，取得准确且高纯度的质粒载体，为BMP9转基因实验研究提供基础。现将结果报告如下。1材料与方式标本来源搜集正常成人外伤性肝破裂修复术中切除的破裂肝组织，DEPCPBS反复洗涤后备用。总RNA提取将肝组织反复剪碎后，利用QIAGEN公司生产的QIA

6、ampRNABloodMiniKit试剂盒，按操作手册步骤进行肝组织总RNA的提取。OnestepRTPCR扩增及PCR产物胶上回收依照人BMP9在GenBank中的序列设计能扩增BMP9完整开放读码框架的引物，并别离在上、下游引物5'端加入BamHI和XbaI酶切位点，上游引物：5'CTCGGATCCATGTGTCCTGGGGCACTGTGG3',下游引物：5'CTCTCTAGACTACCTGCACCCACACTCTGC3'。RTPCR反映体系为50HL,内含：5XQIAGENOneStepRTPCRBuffer10UL；10mmol/LdXTP2uL

7、；5XQSolution10UL；上游引物(6Hmol/L)5UL；下游引物(6Umol/L)6期杨堂，刘相萍，隋爱华，等.正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆5215UL；EnzymeMix2UL；TotalRNA2Ug；力口RNasefreewater至50ULo逆转录反映条件：5030min,9515min灭活逆转录酶。PCR循环参数：941min、521min、721min,共35个循环，终末72延伸10min。在10g/L的琼脂糖凝胶上进行RTPCR扩增产物的电泳分析。认真切下琼脂糖凝胶中的目的条带，按QIAGEN公司提供的QIAquickGelExtractionKit胶回收试剂

8、盒操作步骤进行PCR产物的凝胶回收。重组真核表达载体的构建及转化感受态大肠杆菌将高效真核表达载体PcDXA4/HisMax和胶回收PCR产物别离行BamHI和XbaI双酶切。酶切反映产物纯化后，T4连接酶进行连接反映。连接反映产物转化感受态大肠杆菌JM109,氨苇青霉素抗性挑选。碱裂解法提取带抗性基因质粒。重组载体限制性酶切分析及DA测序将所提取的质粒进行BamHI与XbaI双酶切鉴定,将初步鉴定为带有插入片段的重组质粒送往上海生工生物技术进行DNA测序。2结果RTPCR检测以成人肝组织总RNA为模板进行RTPCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1。产物大小约kb,符合人BMP9在

9、GenBank中的开放读码框架序列大小。重组载体限制性酶切分析未经重组pcDNA4/HisMax载体经BamHI与XbaI双酶切后，产生约kb大小线性化载体DNA（图2）。重组pcDNA4/HisMaxBMP9载体经BamHI与XbaI双酶切后，产生约、kb大小线性载体及BMP9两条片段（图2）。DNA测序将酶切鉴定后的重组质粒进行DNA测序，测序结果与BMP9在GenBank中的开放读码框架序列完全一致，说明取得的目的基因正确。3讨论BMPs为TGFB超分子家族中的一个特殊亚族，其在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力。在发育和(或)生长进程中，BMP的信号传递关于生物体超级重要3oBMP9是

10、引人关注的BMPs家族的一员，其在骨代谢及其他很多方面具有重要的临床应用价值。BMP9第一从胎鼠肝cDNA文库进行了克隆，表现出与细胞特异性受体的结合特性4。MILLER等4描述了BMP9的细胞表达和受体结合特性。研窕显示，成年鼠BMP9要紧显现于肝脏。肝脏的非实质细胞、肝星形细胞和肝内皮细胞(LEC)等表达BMP9o研究发觉，BMP9信号通过自分泌和(或)旁分泌机制在肝窦中触发。BMP9在减少肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸竣激酶(PEPCK)的表达和在肌管中激活丝苏氨酸激酶(Akt)有确切作用20在神经系统中，BMP9的作用要紧包括两方面。第一，BMP9增进胚胎原始神经元的乙酰胆碱合成5。来自胚胎

11、鼠的原始细胞，在细胞培育中加入rhBMP9可呈时刻浓度依托增加细胞产生乙酰胆碱。还可诱导胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱小泡转运体的表达6oBMP9与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对神经系统发育起和谐作用，bFGF增进原始细胞的增殖，维持原始细胞特性的一致，BMP9那么增进细胞分化，维持种族特异性。BMP9还在调剂造血干细胞的生长中有双向作用7：体外高浓度BMP9有抑制体外克隆造血祖细胞集落形成单位的增加效应，低浓度BMP9那么显著增进体外克隆造血祖细胞集落形成单位增殖。本实验对人BMP9全长读码框架进行了完整克隆,取得了准确且纯度很高的重组载体，为这一多能细胞因子在创伤修复、内分泌、神经系统和

12、造血系统等临床领域的转基因应用实验研究提供了坚实的基础。【参考文献】UWOZNEYJM,ROSENV,CELESTEAJ,etal.Novelregulatorsofboneformation：molecularclonesandactivities).Science,1988,242:15281534.2张凌，杨坚毅.骨形态发生蛋白9临床研究进展J.医学分子生物学杂志,2004,1(2):119121.3SONGJJ,CELESTEAJ,KONGFM,etal.Bonemorphorgeneticprotein9bindstolivercellsandstimulatesproliferationJ.Endocrinology,1995,136:42934297.4MILLERAF,HARVEYS,THIESRS,etal.Bonemorphogeneticprotein9anautocrine/paracrinecytokineintheliverLJ.JBiolChern,2000,275(24):1793717945.5LOPEZCOVIELLAI,BERSEB,THIESRS,etal.Upregulatingofacetylcholinesynthesisbybonemorphogeneticprotein9inamur