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文档简介
1、重叠PCR (Overlap PCR)的基 本原理 及其简单运用刘梦鸽谢志能曹志秦朱建勋林福龙2016.06.08重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。简介特点:u可简单迅速将两个DNA片段连在一起,用于嵌合体基因的构建。u可以进行定点突变。u可以在两基因片段间加入其他序列酶切位点或者标签。u丰富的PCR的扩增范围,尤其在获得长DNA片段方面,省去常规克隆的繁琐。2目的基因5,5
2、,3,3,解旋、退火延伸第二轮扩增大量目的基因多次次扩增PCR图解运用通过酶切法得到相应的粘性末端,再利用连接酶得到任务:两个基因片段,或者一个基因和启动子、终止子要连接在一起。常用的方法1.没有合适的酶切位点2.酶昂贵,使用少重叠PCR技术迅速、经济、简单易行4不可行几个主要的运用大于10000bp的基因基因A基因B基因A+B目的基因CDS1CDS2CDS3内含子内含子无内含子的编码序列引物的设计基因1基因2F1 引物R2引物R1引物F2 引物基因1基因2基因1基因2碱基相同区域,至少20bp基因1基因2PCR怎么样发生反应?PCR扩增PCR扩增6反应机理5555333355335533加入
3、酶,buffer等反应液。PCR仪中解链,退火单链模板结合F1 引物R1引物F2 引物R2 引物无目标产物5533加入F1引物、R2引物5533F1 引物R2 引物大量扩增目的基因基因A基因B7在定点突变方面的应用 G C A A A G G C A T C G A C G T T T C C G T A G C TF1引物F2引物R1引物R2引物碱基同源区域突变碱基突变碱基:可以在引物上换成任何其他碱基。碱基同源区域:保证20bp左右,这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。 G C A A AC G T T TG C A A A T G C A T C G AC G T T T A
4、 C G T A G C TF1引物R1引物F2引物R2引物G C A A A T G C A T C G AC G T T T A C G T A G C TOverlap PCR得到突变后的目的基因8上述反应体系中,反应液的加入有两种不同的方式u一种是先加入酶,模板(基因A和B)buffer,dNTP,水。经过5个循环得到完整的目的基因。然后入引物,大量扩增目的基因。虽然这样操作繁琐,但是可以得到特异性扩增产物。u另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时,但是会出现非特异扩增条带,影响胶回收,产量也会减少。9注意事项1、两基因模板间的重叠部分不能少于20bp,否则退火时模
5、板贴不紧,得不到融合的目的基因。2、四条引物的TM值尽量保持相同或一致,利于引物的灵活使用。3、控制重叠PCR的循环次数比一般PCR少,这样可以减少非特异性条带。4、控制PCR模板的浓度,已经融合模板的比例。一般控制摩尔浓度比为1:1,且质量在20ng左右。10谢 谢11OVER-LAP PCR得到完整基因ComponentVolume前1067bp片段1 l(20ng)后1174bp片段1 l(20ng)10 LA Buffer 5 l2.5 mM dNTP 4 lLA Taq 0.5 lPCR grade water38.5 lTotal reaction volume50 l Cycling conditionsPre-denaturation:98, 2 min.Denaturation:98, 30 sec.Annealing:60, 30 sec.Extension:72,1 min.Extension:72,5 min.Finally: 4 , .5 cycle加入100 M浓度的F和R引物各0.5 l Cycling conditionsPre-denaturation:98, 2 min.Denaturation:98, 30 sec.Annealing:65, 30 sec.
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