构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究

1、构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究 11-02-08 17:03:00 编辑：studa20 作者：王静，郭立国，冯金升，任红茹【摘要】【关键词】 组织工程；心肌细胞；PC12细胞；共培养；神经支配；神经生长因子 Abstract：To investigate the possibility of neuronal PC12 cells being used as models to investigate the innervation of tissue-engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmyocytes i

2、solated with using 0.25% trypsin containing 0.04%EDTA were cocultured with the NGF induced sympathetic neuron-like PC12 cells in liquid type I collagen liquid . After that , H.E. staining , immunhistochemistry staining and transmission electron microscopy were used to evaluate it. Result showed that

3、 in the 3-D co-culture model, NGF induced PC12 cells outgrew processes which reached the surface of the cardiacmyocytes and moved along with the beat of cardiomyocytes. Their varicosities also touched with cariamyocytes.The results of our study suggest that PC12 cells is a feasible model to be used

4、in the study of neural innervation of tissue engineered cardiac tissue. And the cardiomyocytes may be innervated in this model. Key words：Tissue engineering； Cardiomyocytes； PC12;；Co-culture；Innervation； Nerve growth factor 1 引 言 神经系统对机体各组织、器官及系统的发生、发育过程具有重要作用。神经系统使机体各部分在功能上成为整体。近年来，组织工程研究发展迅速，国内外研究

5、人员相继成功地体外复制了软骨1、骨2、皮肤3以及心肌4等组织。但是，要保证组织工程化产品在体内移植后的存活，充分的血液供应和完善的神经支配起着决定性因素。如何在构建工程化组织的同时重建其血液供应和神经支配，已成为组织工程研究从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。到目前为止，工程化心肌组织的血管化5研究进展顺利，而其神经支配研究由于神经系统的复杂性及缺乏合适的体外模型，目前尚未见报道。 心肌和其他肌肉组织一样，神经的有效支配在其发挥正常生理功能方面起着重要作用。Dianne6等（1991年）将胸腰部交感神经节和心肌细胞共培养，发现具有肾上腺素能支配的心肌细胞的体积明显增大，表明神经支配有利于心肌

6、细胞的生长。李振中7等（1996年）将大鼠脊神经节与心肌细胞联合培养，发现神经纤维终止于搏动的心肌细胞表面。上述通过二维条件下，心肌细胞与神经细胞共培养的结果表明，神经细胞与心肌细胞共培养能够相互影响，并有利于心肌细胞的生长发育和功能的发挥。 由于原代分离培养的交感神经元对体外生存环境要求较高，而NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞培养条件更为简单，培养过程中状态也相对稳定。工程化心肌组织的培养环境主要涉及到心肌组织的生长与存活，因此很难同时满足原代分离神经元的生长要求。基于此，本研究选用NGF诱导分化的PC12细胞与心肌细胞在液态胶原中共培养作为模型，对构建具有神经支配的工程化心肌组织进行

7、了初步的探索性研究，以探讨体外再造具有神经支配的心肌组织工程的可行性，并为心肌组织工程的神经支配研究提供初步的资料。 2 材料与方法 2.1 材料 22 方法 11-02-08 17:03:00 编辑：studa20 3结 果 3.1 相差显微镜下观察的结果 相差显微镜下观察，第二天即可见单个的神经细胞长出突起，随着时间的延长，长出突起的细胞越来越多，突起也越来越长，在心肌细胞的表面延伸（见图1A）。心肌细胞在培养的第二天即可见单个细胞在跳动，第三天即可见一簇一簇的细胞在跳动，第五天神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一起跳动（见图1B）。图1 PC12与心肌细胞在液态

8、胶原中混合培养的相差显微 镜下观察的结果 A.神经细胞长出的神经突起（）分别到达心肌细胞 （）的表面(40) B.神经细胞长出的神经突起（）呈放射状到达心肌 细胞的表面并随心肌细胞一起跳动(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色结果 由于本实验采用低密度的PC12细胞植入，因此PC12细胞分散在原代心肌细胞的网络中。PC12细胞的核较大，而心肌细胞的核较小，核均为蓝色（见图2）。 3.3 免疫组化染色结果 采用a-肌小节肌动蛋白免疫

9、组化染色对心肌细胞进行鉴定，胞浆呈棕色(见图3A)。采用NF对神经纤维进行免疫组化染色（见图3B），可观察到NF阳性的细胞胞核较大，其周围有一些染色阴性的心肌细胞，胞核较小。 3.4 透射电镜观察结果 PC12细胞与新生大鼠心肌细胞在液态胶原中混合培养后，图中可见心肌细胞、心肌纤维和神经突起。N1、N2 为神经纤维，C为心肌细胞（见图4）。M为心肌纤维（见图5），S为PC12与心肌细胞之间的突触（见图6）。4 讨 论 本研究以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠心肌细胞共培养和体外构建组织工程化心肌片层的研究为基础，以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠新室肌细胞为种子

10、细胞，以胶原、Matrigel为支架材料，进行构建具有神经支配的工程化心肌片层的初步探索性研究。通过组织学、免疫组化的检测与透射电镜的观察，发现PC12细胞在三维条件下，经NGF诱导产生较长的神经突起；PC12细胞与心肌细胞在三维条件下共培养，神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面与心肌细胞一起跳动，且长出的神经突起能与原代心肌细胞形成形态上非常疑似突触连接的结构。 由于各组织与器官中神经系统的复杂性，到目前为止，组织工程化产品的神经支配研究进展相对比较缓慢，仅在骨组织工程的神经支配研究中取得部分进展，张元平等10（2005）将感觉神经、运动神经分别植入组织工程骨修复兔股骨缺损，与单

11、纯组织工程骨和组织工程骨中植入血管束的修复效果相比较，发现利用感觉神经束植入的方法可以提高组织工程骨的成骨作用,而植入运动神经束却无此作用。这项研究为组织工程骨的神经化重建奠定了一定的基础。而其它组织工程化产品的神经支配研究则未见报道。 近年来组织工程研究领域发展迅速，心肌组织工程研究也取得了很大的进展，国内外有关心肌组织构建物的报道日益增多，德国科学家Zimmermann 等人11（2002年）成功在体外构建了组织工程心肌条带，军事医学科学院赵云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基础上，构建出类似天然心肌的心肌条带，并对细胞接种浓度及胶原凝胶含量与再造条件的关系进行了深入研

12、究。上述体外培养的可供移植的环状条带给治疗心脏疾患带来了新的希望。但是，要保证工程化心肌组织在体内移植后的存活，充分的血液供应和完善的神经支配起着决定性因素。 随着心肌组织工程研究深入，以及向临床过渡的逐渐展开，一个主要的问题就是如何使构建的工程化心肌组织在体内存活并迅速发挥作用。带有血管系统和神经支配的复合工程化心肌组织符合仿生学观点，是理想的解决方案。关于心肌组织血液供应的形式已有较广泛的研究，比如, 国内外一些实验室应用混合细胞构建工程化组织的技术方法，观察不同细胞间的相互作用对血管形成的影响, 尝试进行工程组织体外人工血管化，使移植后的组织尽快与宿主之间建立血液循环。Zimmerman

13、n等13（2003）发现，在缺血模型中，利用混有其它细胞的心肌细胞构建的工程化心肌组织的心肌收缩力比单纯由心肌细胞构建的强两倍。不仅如此，Zimmermann等14（2002）还观察到，混合细胞构建的工程化心肌组织，同时出现了初级毛细血管和大血管样结构。这些血管样结构在移植后较快与宿主建立了血液循环。 在心肌组织的神经支配方面，由于心肌的神经支配比较复杂，且没有合适的体外研究模型。因此，一方面要对心脏神经的解剖学、形态学、生理学做进一步的研究，另一方面应对心肌组织工程神经支配的方式进行必要的探索，以便加快心肌组织工程向临床的应用。虽然近年来心肌组织工程血管化研究发展迅速，但是，到目前为止，心肌

14、组织工程的神经支配研究尚未见报道。本研究是在以往研究的基础上，首次对工程化心肌组织的神经支配进行探索性研究。【参考文献】 1Masuda K,HejnaMJ, HejnaMJ.A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocytes:the alginate-recovered-chondrocyte(ARC)methodJ. Journal of Orthopaedic Research,2003,21:139-148.2Devin JE,Lau

15、rencin CT, Laurencin CT .Three-dimensional deg 11-02-08 17:03:00 编辑：studa20 3结 果 3.1 相差显微镜下观察的结果 相差显微镜下观察，第二天即可见单个的神经细胞长出突起，随着时间的延长，长出突起的细胞越来越多，突起也越来越长，在心肌细胞的表面延伸（见图1A）。心肌细胞在培养的第二天即可见单个细胞在跳动，第三天即可见一簇一簇的细胞在跳动，第五天神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一起跳动（见图1B）。图1 PC12与心肌细胞在液态胶原中混合培养的相差显微 镜下观察的结果 A.神经细胞长出的神经突

16、起（）分别到达心肌细胞 （）的表面(40) B.神经细胞长出的神经突起（）呈放射状到达心肌 细胞的表面并随心肌细胞一起跳动(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色结果 由于本实验采用低密度的PC12细胞植入，因此PC12细胞分散在原代心肌细胞的网络中。PC12细胞的核较大，而心肌细胞的核较小，核均为蓝色（见图2）。 3.3 免疫组化染色结果 采用a-肌小节肌动蛋白免疫组化染色对心肌细胞进行鉴定，胞浆呈棕色(见图3A)。采用NF对神经

17、纤维进行免疫组化染色（见图3B），可观察到NF阳性的细胞胞核较大，其周围有一些染色阴性的心肌细胞，胞核较小。 3.4 透射电镜观察结果 PC12细胞与新生大鼠心肌细胞在液态胶原中混合培养后，图中可见心肌细胞、心肌纤维和神经突起。N1、N2 为神经纤维，C为心肌细胞（见图4）。M为心肌纤维（见图5），S为PC12与心肌细胞之间的突触（见图6）。4 讨 论 本研究以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠心肌细胞共培养和体外构建组织工程化心肌片层的研究为基础，以NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠新室肌细胞为种子细胞，以胶原、Matrigel为支架材料，进行构建具有神经支配的工

18、程化心肌片层的初步探索性研究。通过组织学、免疫组化的检测与透射电镜的观察，发现PC12细胞在三维条件下，经NGF诱导产生较长的神经突起；PC12细胞与心肌细胞在三维条件下共培养，神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面与心肌细胞一起跳动，且长出的神经突起能与原代心肌细胞形成形态上非常疑似突触连接的结构。 由于各组织与器官中神经系统的复杂性，到目前为止，组织工程化产品的神经支配研究进展相对比较缓慢，仅在骨组织工程的神经支配研究中取得部分进展，张元平等10（2005）将感觉神经、运动神经分别植入组织工程骨修复兔股骨缺损，与单纯组织工程骨和组织工程骨中植入血管束的修复效果相比较，发现利用感觉

19、神经束植入的方法可以提高组织工程骨的成骨作用,而植入运动神经束却无此作用。这项研究为组织工程骨的神经化重建奠定了一定的基础。而其它组织工程化产品的神经支配研究则未见报道。 近年来组织工程研究领域发展迅速，心肌组织工程研究也取得了很大的进展，国内外有关心肌组织构建物的报道日益增多，德国科学家Zimmermann 等人11（2002年）成功在体外构建了组织工程心肌条带，军事医学科学院赵云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基础上，构建出类似天然心肌的心肌条带，并对细胞接种浓度及胶原凝胶含量与再造条件的关系进行了深入研究。上述体外培养的可供移植的环状条带给治疗心脏疾患带来了新的希望。但是，要保证工程化心肌组织在体内移植后的存活，充分的血液供应和完善的神经支配起着决定性因素。 随着心肌组织工程研究深入，以及向临床过渡的逐渐展开，一个主要的问题就是如何使构建的工程化心肌组织在体内存活并迅速发挥作用。带有血管系统和神经支配的复合工程化心肌组织符合仿生学观点，是理想的解决方案。关于心肌组织血液供应的形式已有较广泛的研究，比如, 国内外一些实验室应用混合细胞构建工程化组织的技术方法，观察不同细胞间的相互作用对血管形成的影响, 尝试进行工程组织体外人工血管化，使移植后的组织尽快与宿主之间建