早老性痴呆疫苗的研究进展

1、早老性痴呆疫苗的研究进展     【关键词】  早老性痴呆；疫苗早老性痴呆又称阿尔茨海默氏病（AD)，是一种以记忆力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的脑退行性疾病。目前为止，AD的发病机制不完全清楚，也没有很好的药物治疗。大多数研究者认为，淀粉样蛋白（A）在脑内的异常沉积是AD发病的关键，因此研究如何阻断和延迟AD患者早期A的聚积以及如何消除已形成的A斑块沉积成为治疗AD的切入点。通过免疫学的方法减少和清除A可能是治疗AD的重要途径，以A作为免疫原制备疫苗来干预已成为治疗AD的一个重要方向，本文介绍AD疫苗研究的最新进展。1  疫苗

2、研制的理论基础    疫苗研制的理论依据来源于人们对AD病因及发病机制的认识。近年的研究发现环境或基因突变导致淀粉样前体蛋白(APP)代谢异常，在神经元细胞外淀粉样蛋白沉积，形成早老性斑的中心，并造成神经元损伤，大脑发生萎缩引起痴呆症。    关于AD的发病机制，目前普遍认为是A病因学说。病理上AD表现为在神经细胞之间出现大量的淀粉样纤维沉积，神经细胞内出现神经原纤维缠结，伴有神经细胞的死亡，神经突触和皮质神经细胞胆碱能受体丢失。A是分泌酶和分泌酶分解APP形成的。A可聚集形成寡聚物以及A衍生的扩散配体，它们能快速地、高亲和性地与突触

3、和细胞膜结合，引起钙内流和细胞凋亡1，2。A也诱导脂质的过氧化，产生自由基和反应氧族，自由基和反应氧族可导致细胞骨架和线粒体的解体，从而引起细胞凋亡3。A致神经细胞凋亡的作用还与它引起的微管相关蛋白(Tau)蛋白过磷酸化和半胱氨酸蛋白酶(caspase3)的活化有关。神经原纤维缠结是神经元异常集聚形成的不溶性复合物，主要由过磷酸化的细胞骨架蛋白Tau蛋白组成。A诱导氧化应激可激活一些激酶，这些激酶使微管蛋白磷酸化。由于Tau蛋白过磷酸化，影响Tau蛋白的结合和稳定微管的能力，从而引起神经细胞凋亡4，5。由此可见，A的生成并聚合成纤维沉积，继而引起神经细胞的损害是AD发生发展机制中的关键环节。从

4、理论上分析，如果能抑制A的沉积或促进A的清除，有可能阻止AD的进展甚至逆转其病理过程，通过免疫学的方法减少和清除A在脑内的沉积可能成为AD治疗领域中的一条重要途径6。2  疫苗的种类2.1  A42多肽疫苗  从老年斑和神经纤维缠结中分离出分子量4 200的淀粉样肽表明它可能是一个重要的病因学因素7。105例59岁到109岁的衰老和痴呆症病人的尸检结果表明A与衰老和痴呆密切相关8。因此最先研制的疫苗是以A蛋白作为免疫原制备的疫苗（Amyloidbeta protein,A42疫苗）。这种疫苗是以合成全长A142多肽为基础，它可以刺激机体产生相应抗体，通过与A抗原发

5、生反应，激活巨噬细胞等清除抗原抗体复合物，从而达到清除A沉积的目的。Schenk(1999)首次实验证明用A疫苗免疫转基因AD模型鼠(PDAPP)后，可以阻止6 w龄鼠淀粉样蛋白的沉积以及神经性营养不良，对11 w龄的老年鼠可以明显缩小AD样病变范围和缓解其类似AD的病理过程9。Janus和Morgan等进一步研究发现，A42疫苗减少PDAPP鼠脑内老年斑及淀粉样沉积的同时，还逆转了认知、学习和记忆障碍等行为上的改变10，11。2002年英国爱尔兰公司研制了一种命名为AN1792AD疫苗，期临床试验未发现明显副反应，但应用于临床期试验时，约6%的受试病人出现了脑膜脑炎而终止试验，经病理学证实脑

6、血管周围有CD4+或CD8+T细胞浸润，提示与T细胞介导的自身免疫反应有关，而与病人血清中的抗体水平无关12，13。鉴于此，最近有报道通过阻断T细胞应答所需的信号途径来降低A多肽疫苗引起的副作用14。     2.2  A短肽疫苗  由于上述A42多肽疫苗可引起T细胞介导的自身免疫反应性脑膜脑炎，不少学者研究了A多肽疫苗的结构与免疫原性的关系，发现A多肽疫苗具有T细胞和B细胞表位，而引起A多肽疫苗副作用的主要是T细胞表位。为减轻A多肽疫苗引起的副作用，有学者通过预先设计抗原表位来减小细胞免疫反应和炎症反应。如Kim等以腺病毒载体编码A

7、16作为免疫原诱导产生了针对A蛋白的免疫反应，与编码粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的腺病毒载体同时给予可产生滴度更高的IgG1抗体，是一种抗炎症的Th2型反应，免疫组化分析免疫小鼠脑内无炎症相关的病理改变；该抗体能与脑内A老年斑发生反应，证明其有抗体活性，结果表明这种腺病毒载体编码的11个A16连接的肽段是一种更为安全的AD疫苗15。Maier和Lemere设计了一种只具有B细胞表位而无T细胞表位的A免疫原，该免疫原在野生鼠和转基因鼠内诱导产生了抗A特异性抗体，但无A特异性细胞免疫16，17。在此基础上，设计者选用4种小分子肽免疫原(分别名为R2xA115、2x A15、T1R A115、T1

8、A115)，与突变大肠杆菌热稳定肠毒素一起鼻内免疫野生鼠，诱导产生了高滴度的抗体；然后用R2x A115或2x A115免疫家族性AD鼠，诱导产生了高滴度的非炎症性Th2型反应(IgG1和IgG2b)，明显减少了老年斑内A的负荷，降低了脑内 A的水平，经水迷宫等行为实验证实2x A115免疫的DAPP鼠的记忆改善与抗A抗体的滴度有关，提示该免疫原是一种有希望的AD疫苗18。Chackerian 将A短肽免疫原与病毒样颗粒连接制备的疫苗免疫小鼠，结果发现该疫苗诱导产生了A抗体反应而无明显的T细胞反应19。2007年美国联合生物医学公司成功研制了一种位点特异性Th AD治疗性疫苗（UBITh），该

9、疫苗选用AN末端114氨基酸短肽作为免疫原，与铝佐剂和多聚CPG寡核苷酸联合使用，可以刺激机体产生特异性抗体。该研究以健康豚鼠、人APP转基因小鼠、成年雄性狒狒、成年雄性和雌性短尾猴为对象，体内、体外试验多参数评价疗效及其安全性。在人APP转基因小鼠的试验中，该疫苗采用肌肉注射，16 w后检测到相应的抗体，该抗体具有中和A的毒性作用并有助于老年斑中A的清除，被免疫小鼠脑组织病理学观察其神经病变明显减轻，未见明显T细胞浸润和胶质细胞的激活。另外，在18只猴身上进行了急性和慢性毒性实验，结果表明各项生理指标及行为正常；无变态反应；常规组织学检查未见各个脏器的病理改变；免疫组织化学检查脑组织内无CD

10、3+、CD4+、CD8+T细胞浸润和激活的胶质细胞或胶质细胞的增生。体外细胞免疫试验表明A114免疫原刺激外周血单个核细胞的增殖反应为阴性，而对照用A142免疫原为阳性。这些研究表明UBITh AD疫苗用于预防和治疗AD是安全有效的20。2.3  A口服疫苗  免疫原进入机体的途径可影响机体所产生免疫应答的强度。日本学者尝试通过改变免疫途径来降低A多肽疫苗的副作用。他们发现口服腺相关病毒载体重组疫苗和鼻部给予仙台病毒重组的A143/IL10均能诱导上皮细胞长期表达并向黏膜免疫系统递呈A蛋白，4 w后鼠血清中抗体水平明显升高，并能抑制A的聚集，经免疫组化分析鼠脑组织A负荷较对

11、照组鼠明显减少，没有发现任何器官的炎症反应21。Tabira22也用腺相关病毒重组A疫苗口服一次，可见抗体产生并维持高滴度达6个月之久，在PDAPP鼠和老年猴中显示A负荷明显减少，未观察到任何副作用。Mouri等23构建了重组腺相关病毒为载体的AcDNA口服疫苗，对有进行性认知缺失的Tg2576鼠进行免疫，在其10月龄时一次性给予该疫苗，3个月后发现免疫小鼠的认知缺失明显减轻，脑组织内A沉积、不溶性A、可溶性A寡聚体以及突触变性的程度均减少。上述研究提示A疫苗经黏膜免疫治疗AD是有效的。     2.4  A DNA疫苗  在现代疫苗

12、的研制中，DNA疫苗具有免疫效果好，应答持久，有预防和治疗双重作用，且制备方法简单的优点被受关注。近来有学者着手研制A DNA疫苗并获得了明显疗效而没有副作用24，25。如Qu及其同事采用基因枪将A42基因疫苗直接导入APPswe/PS1DeltaE9转基因鼠，发现免疫鼠产生了针对A42的IgG1抗体反应，与对照鼠比，脑内A的含量减少了41%，血浆中A增加了43%，在大脑皮质和海马回由A形成的老年斑分别减少了51%和52%，且免疫小鼠的神经胶质细胞的活化状态明显低于对照鼠。用同样的方法免疫恒河猴也产生了抗A42的抗体。这些结果提示基因枪介导的A42基因免疫可有效诱导Th2的免疫反应，并能减少脑

13、内A的水平。与传统的直接注射A蛋白疫苗相比，ADNA疫苗诱导抗体所需时间更长，疗效相对缓和，更为持久26。为了减少A多肽疫苗的副作用，在用A多肽免疫原制备DNA疫苗的基础上，Movsesyan从A多肽基因中筛选出表达11个氨基酸组成的短肽基因，该基因产物具有B细胞表位特征，将其与一种巨噬细胞来源的趋化因子（作为免疫原的分子佐剂）基因融合制备的疫苗，经免疫34月龄的3XTgAD鼠，发现其能诱导产生高滴度的A抗体。该抗体能抑制老年鼠A在脑内的沉积，并可减轻神经胶质细胞的激活，进而防止行为异常，未增加脑微血管出血现象，说明此疫苗有一定的安全性和有效性，可进一步扩大研究对象深入研究27。ADNA疫苗的

14、研制为AD的疫苗治疗开辟了新的途径。    AD治疗的关键是降低A的同时能达到安全治疗目的，降低脑内A沉积从而延缓疾病的进展，上述针对A病因学说而研制的各种A疫苗在这一领域取得了一定进展，为治疗AD带来了希望。但是这种预防和治疗AD的方法需要精心选择抗原和抗体，以最大限度地提高疗效而降低其副作用。目前已有的研究证实通过免疫学方法清除A来预防和治疗AD是可行的，要获得理想的AD疫苗还需要深入研究A的清除机制。【关键词】  早老性痴呆；疫苗早老性痴呆又称阿尔茨海默氏病（AD)，是一种以记忆力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的脑退行性疾病。目前为止，AD的发

15、病机制不完全清楚，也没有很好的药物治疗。大多数研究者认为，淀粉样蛋白（A）在脑内的异常沉积是AD发病的关键，因此研究如何阻断和延迟AD患者早期A的聚积以及如何消除已形成的A斑块沉积成为治疗AD的切入点。通过免疫学的方法减少和清除A可能是治疗AD的重要途径，以A作为免疫原制备疫苗来干预已成为治疗AD的一个重要方向，本文介绍AD疫苗研究的最新进展。1  疫苗研制的理论基础    疫苗研制的理论依据来源于人们对AD病因及发病机制的认识。近年的研究发现环境或基因突变导致淀粉样前体蛋白(APP)代谢异常，在神经元细胞外淀粉样蛋白沉积，形成早老性斑的中心，并造成神经

16、元损伤，大脑发生萎缩引起痴呆症。    关于AD的发病机制，目前普遍认为是A病因学说。病理上AD表现为在神经细胞之间出现大量的淀粉样纤维沉积，神经细胞内出现神经原纤维缠结，伴有神经细胞的死亡，神经突触和皮质神经细胞胆碱能受体丢失。A是分泌酶和分泌酶分解APP形成的。A可聚集形成寡聚物以及A衍生的扩散配体，它们能快速地、高亲和性地与突触和细胞膜结合，引起钙内流和细胞凋亡1，2。A也诱导脂质的过氧化，产生自由基和反应氧族，自由基和反应氧族可导致细胞骨架和线粒体的解体，从而引起细胞凋亡3。A致神经细胞凋亡的作用还与它引起的微管相关蛋白(Tau)蛋白过磷酸化和半胱氨酸蛋白

17、酶(caspase3)的活化有关。神经原纤维缠结是神经元异常集聚形成的不溶性复合物，主要由过磷酸化的细胞骨架蛋白Tau蛋白组成。A诱导氧化应激可激活一些激酶，这些激酶使微管蛋白磷酸化。由于Tau蛋白过磷酸化，影响Tau蛋白的结合和稳定微管的能力，从而引起神经细胞凋亡4，5。由此可见，A的生成并聚合成纤维沉积，继而引起神经细胞的损害是AD发生发展机制中的关键环节。从理论上分析，如果能抑制A的沉积或促进A的清除，有可能阻止AD的进展甚至逆转其病理过程，通过免疫学的方法减少和清除A在脑内的沉积可能成为AD治疗领域中的一条重要途径6。     2  疫

18、苗的种类2.1  A42多肽疫苗  从老年斑和神经纤维缠结中分离出分子量4 200的淀粉样肽表明它可能是一个重要的病因学因素7。105例59岁到109岁的衰老和痴呆症病人的尸检结果表明A与衰老和痴呆密切相关8。因此最先研制的疫苗是以A蛋白作为免疫原制备的疫苗（Amyloidbeta protein,A42疫苗）。这种疫苗是以合成全长A142多肽为基础，它可以刺激机体产生相应抗体，通过与A抗原发生反应，激活巨噬细胞等清除抗原抗体复合物，从而达到清除A沉积的目的。Schenk(1999)首次实验证明用A疫苗免疫转基因AD模型鼠(PDAPP)后，可以阻止6 w龄鼠淀粉样蛋白的沉积

19、以及神经性营养不良，对11 w龄的老年鼠可以明显缩小AD样病变范围和缓解其类似AD的病理过程9。Janus和Morgan等进一步研究发现，A42疫苗减少PDAPP鼠脑内老年斑及淀粉样沉积的同时，还逆转了认知、学习和记忆障碍等行为上的改变10，11。2002年英国爱尔兰公司研制了一种命名为AN1792AD疫苗，期临床试验未发现明显副反应，但应用于临床期试验时，约6%的受试病人出现了脑膜脑炎而终止试验，经病理学证实脑血管周围有CD4+或CD8+T细胞浸润，提示与T细胞介导的自身免疫反应有关，而与病人血清中的抗体水平无关12，13。鉴于此，最近有报道通过阻断T细胞应答所需的信号途径来降低A多肽疫苗引

20、起的副作用14。2.2  A短肽疫苗  由于上述A42多肽疫苗可引起T细胞介导的自身免疫反应性脑膜脑炎，不少学者研究了A多肽疫苗的结构与免疫原性的关系，发现A多肽疫苗具有T细胞和B细胞表位，而引起A多肽疫苗副作用的主要是T细胞表位。为减轻A多肽疫苗引起的副作用，有学者通过预先设计抗原表位来减小细胞免疫反应和炎症反应。如Kim等以腺病毒载体编码A16作为免疫原诱导产生了针对A蛋白的免疫反应，与编码粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的腺病毒载体同时给予可产生滴度更高的IgG1抗体，是一种抗炎症的Th2型反应，免疫组化分析免疫小鼠脑内无炎症相关的病理改变；该抗体能与脑内A老年斑发生反应，证明其有抗体活性，结果表明这种腺病毒载体编码的11个A16连接的肽段是一种更为安全的AD疫苗15。Maier和Lemere设计了一种只具有B细胞表位而无T细胞表位的A免疫原，该免疫原在野生鼠和转基因鼠内诱导产生了抗A特异性抗体，但无A特异性细胞免疫16，17。在此基础上，设计者选用4种小分子肽免疫原(分别名为R2xA115、2x A15、T1R A115、T1 A115)，与突变大肠杆菌热稳定肠毒素一起鼻内免疫野生鼠，