慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究

1、慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究         08-07-05 15:58:00     作者：ZHANG Xu,     编辑：studa0714【摘要】  目的： 分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法： 采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果： 分离培养出人骨髓来源的MSCs，并用

2、携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论： 获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰，为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。 【关键词】  间质干细胞; 慢病毒; 转染Abstract  Objective: To isolate and culture mesenchymal stem cells（MSCs） derived from human bone marrow and transfect the cells by lentiviral vectors.Methods： The tissue adherent cul

3、ture method was used to isolate MSCs from human bone marrow. The MSCs were transfected by lentiviral vectors using lipofectamine 2000. Results： Human bone marrow MSCs were successfully isolated and efficiently transfected by EGFP-expressing lentiviral vectors. Conclusion： Human bone marrow MSCs have

4、 been  transfected by lentivirus, which will play a role in researching on the function of MSCs in gene and tissue engineering.Key words  mesenchymal stem cells； lentiviral vector;  transfection间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于多种组织，主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、脐血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源

5、。MSCs增殖能力强，体内外均具有多向分化潜能，基因修饰后保持原有多潜能性的同时可持续稳定表达外源基因；体外转染和培养一段时间移植至体内仍可存活，并能够迁移至病变部位,因而其成为基因治疗研究领域令人关注的靶细胞1。因此，本研究从人骨髓组织中分离培养出MSCs并体外扩增用于慢病毒转染，为进一步利用MSCs进行基因治疗奠定基础。1  材料与方法1.1  标本和主要试剂  成人骨髓（江苏大学附属医院），慢病毒三质粒系统FUGW，pCMVR-delta8.9和VSVG（上海医学遗传所惠赠），人胚肾293 T（本实验室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白

6、酶（Sigma公司），lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Toyobo公司），PCR试剂（Takara公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），限制性内切酶BamH和EcoR（NEB公司）。引物设计采用primer premier 5.0软件，由上海生物工程有限公司合成。1.2  主要仪器  二氧化碳培养箱（Forma公司），Beckman SW28 Rotor超速离心机（Beckman公司），PCR仪（Thermo Hybaid

7、公司），流式细胞仪(FACS Calibur, BD公司)，倒置式生物显微镜(TE300, Nikon公司)，细胞培养瓶和培养皿（Corning公司）。1.3  方法表1  PCR引物序列（略）Tab 1  Primer sequences for PCR2  结果2.1  人骨髓MSCs分离培养和表面标志  全骨髓组织原代贴壁培养5 d后，倒置显微镜下观察见单个或少量集落生长的贴壁细胞，呈短梭形或针尖状。随细胞培养时间延长，细胞集落不断地扩大并形成融合单层，细胞形态大多呈长梭形或多角形(图1)。流式分析显示CD13，CD29， CD44，CD105，HLA-表达阳性，CD31，CD34，HLA-DR阴性表达(图2)，表明获得人骨髓来源的MSCs。(a) 骨髓组织原代培养第7天(×100)   (b) 骨髓组织原代培养第7天(×200)图1  人骨髓MSCs的形态学特征（略）Fig 1  Morphological characteristic of humanbone marrow MSCs依次为CD13，CD29，