异博定增加化疗中卵巢癌细胞凋亡的研究

1、    异博定增加化疗中卵巢癌细胞凋亡的研究        摘要目的探讨异博定对促进化疗药物诱使卵巢癌细胞增加凋亡因子表达的作用。方法从48例首次手术及17例复发卵巢癌患者腹水中提取富含癌细胞的悬液，应用三种荧光单克隆抗体P170、CD95及Apo2.7标记，经流式细胞仪检测。结果应用异博定化疗后癌细胞CD95及Apo2.7表达含量均高于对照组；异博定对癌细胞P170表达含量无明显影响；复发组癌细胞P170表达含量显著高于初发手术组；化疗可使外周血淋巴细胞CD95及Apo2.

2、7表达含量增加。结论本研究提示异博定具有加强化疗药物增加卵巢癌细胞凋亡的作用，特别是对耐药性患者具有重要的临床应用价值。关键词卵巢肿瘤；异博定；凋亡；化学疗法中分类号R737.31；R730.53文献标识码B文章编号1005-8664(2000)05-23-03 Study on the synergetic effect of isoptin on induced cellular apoptosis of ovarian carcinoma by chemotherapyYUAN Wei,YIN Ge-ping,CHEN Song-fen,et al.(Jinan Military Gen

3、eral hospital,Jinan 250031.)AbstractObjectiveTo explore the role of calcium antagonist-isoptin on the cellular Mdrl product(P170) and apoptosis of ovarian carcinoma in chemotherapy.MethodsThe ascites cancer cells(ACC)were collected in 48 primary and 17 recurred ovarian cancers,immunologically marked

4、 by three kinds of fluorescent monoantibodies-P170,CD95 and Apo2.7 and then determined by flow cytometry.Resultsisoptin did not affect the P170 expression contents in ACC;The CD95 and Apo2.7 expression contents on ACC were statistically improved in isoptin group than in non-isoptin one(P<0.05);Th

5、e P170 contents were statistically improved in recurred group than that in primary one(P<0.05);The CD95 and Apo2.7 contents of peripheral lymphocyte were also improved in isoptin group.ConclusionsThe calcium antagonist-isoptin obviously improves the apoptotic rate of ACC in ovarian carcinoma in c

6、hemotherapy and has important clinical significance.Key wordsovarian tumor;apoptosis;Chemotherapy;isoptin近年来以顺铂(Pt)为主的联合化疗已使卵巢癌患者的生存时间明显延长，但5年生存率却改变不大，其主要原因就是随着化疗时间的延长，癌细胞对多种化疗药物产生耐药性1。而某些钙通道阻滞剂(CPB)例如异博定，为耐药调变剂(Adjustor of resistance)，可部分逆转这种耐药性，增加癌细胞对化疗药物的敏感性2，3。本研究通过对化疗前后卵巢癌腹水癌细胞及外周血淋巴细胞(PBL)多药耐药

7、基因(Multidrug resistance gene.MDR1)表达产物P糖蛋白(Pgp、P170)和凋亡因子Fas抗原(CD95)及线粒体膜蛋白Apo2.7表达的定量对比研究，并结合临床表现，探讨异博定对化疗药物诱导癌细胞凋亡因子表达含量增加的作用以及对PBL的影响。材料及方法一、临床资料：本组48例初发卵巢癌为我院1995年12月至1998年2月住院患者，有完整的临床病理资料，应用异博定者28例(CPB组)、未用者20例(No-CPB组)。手术前先行腹腔穿刺抽取腹水50ml(细胞学检查均见癌细胞)，并行Pt腹腔灌注，同时抽外周静脉血2ml(抗凝)，35天后在行减灭术时又抽腹水及外周静脉

8、血标本。本组术后复发并出现腹水者17例，再予腹腔化疗前及化疗后35天抽腹水50ml,化疗中应用异博定者11例，未用者6例，并观察1个月后腹水增长量。化疗药物及异博定的应用主要是Pt(100mg/M体表面积)单独腹腔灌注，每疗程1次，或加用环磷酰胺静脉滴注(5mg/kg体重)每日1次共5天和/或阿霉素(1.0mg/m体表面积)静滴1次。异博定2040mg口服，每日3次。自化疗前3日至化疗后4日应用，用药期间注意血压、脉搏及心电变化。研究方法一、特殊试剂：异硫氢酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人单克隆抗体P170和CD95、R-藻红蛋白(PE)标记的Apo2.7及用于排除免疫标记误差的羊抗鼠IgG1

9、(作为免疫标记阴性对照)，由法国国际免疫公司生产。淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产。二、外周血淋巴细胞(PBL)的提取：将2ml抗凝静脉血加入淋巴细胞分离液2ml，离心(1500r/min,5min)，提取其中淋巴细胞层，再以磷酸缓冲缓(PBS)2ml漂洗，同速离心2次，弃上清液备用4。三、由腹水富集卵巢癌细胞的悬液(ACC)：无菌抽腹水50ml，肝素抗凝，离心(1500r/m,10min)，弃去上清后加入淋巴细胞分离液2ml，同速离心，收取分离液表面细胞，以2ml PBS漂洗离心1次，弃上清后将细胞加于100%：65%的双层淋巴细胞分离液表面、离心(2500r/m,20min)，

10、吸取65%分离液上界面的细胞即为ACC。取少量细胞涂片，瑞氏染色后光镜下见异型细胞丰富，杂质细胞少。四、单克隆抗体P170、CD95及Apo2.7免疫标记：取4支试管，各加样品500ul，分别加入P170、CD95及Apo2.7及IgG1工作液20ul，避光室温下20分钟。离心(2000r/m,10min)，除上清液后加入PBS 1ml，同速离心1次，弃上清后再加PBS 500ul待检。五、流式细胞仪检测：FACScan型流式仪(美国BD公司产)，上机收集1万个细胞，在Macintosh 650型计算机上用Cellquest Plot软件(BD公司生产)分析数据，打印结果。统计方法用t检验，P

11、170、CD95及Apo2.7含量均以阳性细胞百分率表示5。结果表1腹腔化疗前后PBL凋亡因子表达含量(±SD)分组例化疗前含量化疗后含量CD95(%)Apo2.7(%)CD95(%)Apo2.7(%)CPB组280.36±0.310.22±0.140.88±0.54*0.40±0.24非CPB组201.34±0.280.24±0.170.78±0.490.39±0.29注：?P<0.05(均与同种凋亡因子比较) 表2两组化疗前后腹水中P170凋亡因子表达含量(±SD).分组P170(%)

12、CD95(%)Apo2.7(%)化疗前化疗后化疗前化疗后化疗前化疗后CPB组3.57±2.173.74±2.142.18±0.778.74±3.26?1.46±0.569.77±3.14?非CPB组3.33±2.483.40±2.602.31±0.574.45±2.16?1.22±0.713.76±1.32?注：?P<0.05，?P<0.01(均与同种凋亡因子比较) 表3复发组化疗前后腹水中P170凋亡因子表达含量(±SD).分组例P170(%)CD95

13、(%)Apo2.7(%)化疗前化疗后化疗前化疗后化疗前化疗后CPB组115.42±3.115.97±3.141.79±0.707.41±3.40?1.17±0.566.17±2.57?非CPB组66.34±3.166.88±3.501.86±0.603.27±2.16?0.93±0.411.91±1.32注：?P<0.05，?P<0.01(均与同种凋亡因子比较) 讨论多药抗药性的癌细胞可以过度表达了位于细胞表面的P170糖蛋白，后者属钙通道性质，它在钙离子参与下能

14、加快化疗药物从细胞内的外泄，是癌细胞自身保护的重要机制6。细胞凋亡(Apoptosis)是细胞程序性死亡，与肿瘤细胞的生长、发展密切相关，是研究抗癌药物对肿瘤治疗敏感性非常重要的一项指标7。细胞表面分子CD95(又称Fas因子和Apo-1)属肿瘤坏死因子家族8。Apo2.7抗原位于细胞线粒体膜上9。两种抗原的出现均可以反映细胞凋亡。有实验证实，多种抗癌药物使癌细胞消退是通过细胞凋亡机制，如顺铂及阿霉素等10。故应用抗癌药物等有效手段诱导并促进癌细胞凋亡是肿瘤治疗十分有价值的课题。目前的研究认为卵巢癌5年生存率改观不大的主要障碍是在例行的化疗过程中癌细胞逐渐产生了多药抗药性，故研究能够促进化疗疗

15、效的措施意义重大。以往此类报告多见对癌细胞株的实验研究。本文从卵巢癌腹水中提取出癌细胞探讨在CPB参与下的化疗对癌细胞凋亡程度的影响，有更直接的临床意义。异博定主要通过阻滞钙通道，使P170功能减退或失活，从而提高癌细胞内抗癌药物浓度，减弱了癌细胞对化疗药物抵抗性，增加了化疗疗效。从本文结果看，应用异博定并未减少癌细胞之P170含量，但可显著性加强化疗药物对癌细胞的凋亡作用。这可能是使P170的功能不能发挥，复发组癌细胞之P170含量比初发手术时明显增加，提示复发组在数疗程化疗后，癌细胞多药抗药性的增加。此组未用异博定辅助化疗者，仅见CD95含量增高，而应用者，则见CD95及Apo2.7含量均

16、明显增加，有显著性意义。另外，从对复发组腹腔化疗的近期疗效看，异博定组对腹水增长的抑制程度也好于非-CPB组，提示在复发患者腹腔化疗同时应用异博定的作用较好。腹腔化疗中，应用异博定组外周血淋巴细胞CD95含量较未应用组增加，虽无显著性差异，但提示在应用异博定过程中，应注意保护机体免疫功能。作者简介：袁玮(1970-)，女，山东聊城人，学士，主治医师，从事妇科肿瘤专业。陈诵芬(1942-)，女，北京人，硕士生导师，教授，从事妇科肿瘤专业。袁玮(济南军区总医院妇产科山东济南 250031)尹格平(济南军区总医院妇产科山东济南 250031)陈诵芬(济南军区总医院妇产科山东济南 250031)孙晓明

17、(济南军区总医院妇产科山东济南 250031)陈铭(济南军区总医院妇产科山东济南 250031)参考文献1Nooter K.Multidrug resistance (mdr) genes in human cancerJ.Br J Cancer,1991;63:663-669.2Yang LY,Trujillo JM,Siciliano MJ,et al.Distinct P-glycoprotein expression in the two subclones simultaneously selected from a human colon carcinoma cell line b

18、y cis-diaminodichloroplatium (II).J.Int J Cancer 1993;53:478-81.3梁正来，卞度宏.卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究J.中华妇产科杂志，1996；3(2)：75-78.4尹格平，陈诵芬，孙晓明等.卵巢癌组织及外周血淋巴细胞多药耐药基因表达蛋白的定量研究J.中华妇产科杂志，1998；33(5)：287-289.5孙晓明，尹格平.实体瘤组织细胞粘附分子流式细胞研究方法的建立J.中华医学检验杂志，1997；20(1)：9-11.6Aros S,Suwa H,Mandai M,et al.Expression of multidrug resis