晶体-细胞的相互作用与肾结石

1、    关键字：肾结石草酸钙(CaOx)是肾结石中最常见的晶体物质，它在生物体液中的溶解度非常低。所有人尿中的CaOx都经常处于过饱和状态，在特定的过饱和环境中可能自发产生CaOx沉淀。结石病人以及正常人的尿中常可查到CaOx结晶，而结石病人的CaOx颗粒较大。肾结石的形成是肾内一定大小的晶体潴留或粘附到肾小管上皮细胞上的最终结果。通常认为决定肾结石发展的主要因素是小管液中草酸盐的浓度，结晶调节因子的浓度和活性，以及肾脏内晶体潴留。越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞积极参与了肾结石的病理生理过程，研究CaOx晶体与肾小管上皮细胞的相互作用对探讨尿石症的发

2、生机制有重要意义。一、细胞模型的选择目前已有适合使用的具有明确肾单位片段特征且能长期生长的细胞系。肾源性上皮细胞行组织培养时形成高度分化和有极性的单层细胞，顶部有微绒毛，并有连结复合体。在有渗透性的底物上培养的细胞比在硬塑料培养皿上的细胞分化程度高。根据研究机制选择某一特定的细胞模型，近曲小管细胞常用于研究草酸盐转运机制，因为草酸盐的转运仅发生于肾单位的这一部分。细支以远可见CaOx晶体，因此，研究晶体与上皮细胞之间的相互作用常选择具有远曲小管或集合管特征的肾细胞。LLC-PK1和OK-1细胞分别来源于Hampshire猪和美国负鼠，保留着许多近曲小管的特征，如Na+依赖的糖、氨基酸和磷酸转运

3、功能。取自正常雄性矮脚长耳猎犬肾脏的MDCK细胞被广泛用作远曲小管或集合管的模型。两个独立的细胞系具有完全不同的特征，这证明了细胞系的异质性。用于肾结石研究的另一种肾上皮细胞是BSC-1，它取自非洲绿猴，具体起源不清5。也有用原代培养的大鼠肾髓质集合管细胞(IMCD)研究晶体-细胞的相互作用。无论选择哪种模型系统，一般说来都要进行生理学方面的相关性研究，培养物在形态上和机能上应尽可能模拟体内的细胞模型。细胞系优于原代培养，前者在分裂繁殖过程中形成单层，利于培养。细胞可冻存，将来可恢复培养，可用同一物质重复实验。二、晶体粘附扫描电镜和透射电镜图像显示肾小管管腔表面吸附有晶体，细胞内也存在晶体6。

4、在高草酸尿症大鼠肾脏内发现比管腔直径小得多的CaOx晶体沉积物吸附在肾小管上皮上。所有人的尿中都可查到晶体，提示晶体尿并非都是病理状态。正常人的肾小管上皮细胞可更好地抵制晶体的粘附。细胞表面或晶体表面被功能性物质如TH蛋白(THP)，肾钙素(NC)，葡胺聚糖(GAGs)以及骨桥蛋白(OPN)覆盖，从而得到保护。细胞表面糖缀合物结构和成分的变化可使细胞包被失去阻止晶体粘附的作用7。一水草酸钙(COM)在数秒内即可与细胞表面结合，结合量与COM浓度有密切关系，这种粘附作用可被聚阴离子肝素阻断。其它GAGs成分如硫酸软骨素A，硫酸软骨素B，硫酸乙酰肝素和透明质酸也可阻断这种粘附作用，而硫酸软骨素C除

5、外。另两种聚阴离子聚谷氨酸和聚天冬氨酸也有这一作用。尿中的NC，枸橼酸以及OPN都可抑制晶体与细胞的结合，但THP没有这种作用。用这些物质预处理晶体可起阻断效果，而预处理细胞无效，提示这些物质是作用于晶体表面而起作用。抑制物对晶体结合的抑制遵循Langmuir吸附等温式，表明晶体上抑制物分子结合位点对二者之间的粘附至关重要。聚阴离子鱼精蛋白可迅速逆转晶体与细胞的粘附，这可解释GAGs可逆性调节细胞晶体相互作用的现象8。至于为什么晶体对细胞表面有亲和力，似乎不存在能与晶体结合的特异性细胞表面分子。正常情况下肾小管内形成的晶体将随尿排出。在某些条件下，晶体可获得对细胞表面的高亲和力，此时晶体结合可

6、由有吸引力的离子键或氢键介导，它必须克服快速流动的小管液产生的剪切力。这种结合的证据源于对晶体片层与IMCD细胞表面磷脂片层的对比，提示晶体与质膜间的接触是基于互补分子的静电和氢键9，10。另一方面，COM晶体的结合由细胞表面带负电荷的分子介导。聚阳离子可阻断COM晶体与BSC-1细胞的粘附。此外，用神经氨酸酶或肝素酶预处理的BSC-1和MDCK细胞可抑制COM晶体的结合力，提示唾液酸残基和硫酸乙酰肝素是细胞表面与晶体结合的潜在受体6。而且COM晶体与MDCK细胞的结合似乎与pH或温度有关，并发现由钙螯合诱导的质膜顶部变形可促进晶体的结合。根据以往的研究结果推断，细胞损伤或细胞损害修复后反应性

7、增生可使上皮极性丧失，从而触发晶体潴留。质膜的分子结构改变，细胞表面及小管液内阴离子质和量的变化，以及环境因素如pH的变化在晶体结合中可能起重要作用11。三、晶体内化晶体一旦粘附到细胞表面，至少部分会被摄入细胞内，这代表一种保护性机制，以去除细胞表面潜在的晶体生长点。另一方面，晶体胞吞可作为膜转换的一个非特异性结果。一旦细胞内晶体刺激细胞增生，可暴露新的膜功能区以供晶体结合，成为晶体聚集或晶体生长的位点。此外，有丝分裂也可松弛细胞与基底膜的粘附力，增加细胞脱落机会，从而暴露基底膜，成为尿晶体附着的位点，为结石形成奠定了基础12，13。培养细胞的晶体胞吞作用受肾小管液中正常存在的复合物的影响，体

8、内分子结构的变化可影响这一过程。进入细胞内晶体的命运目前尚不清楚。超微结构研究显示，进入MDCK细胞内的晶体于72小时后消失，提示细胞内存在清除内化晶体的调节机制。还不清楚晶体是被转运至基底部还是管腔内，含晶体的细胞是否从单层上清除掉，然后被新细胞取代。晶体可能在细胞内溶酶体的酸性环境作用下溶解14。在高草酸尿症病人及用致高草酸尿制剂处理的动物中，其肾小管腔内及肾间质均发现CaOx结晶，提示管腔内晶体可能被转运至间质区。给予大鼠诱石饮食9天时，肾小管腔内上皮旁有晶体聚积，部分生长过度。这一结果可解释大颗粒向间质移位，或许只有相对较小的晶体才被小管细胞内化15。也有报道COM晶体可刺激间质细胞生

9、长，可以推测，这些细胞的过度生长可影响细胞外基质，后者反过来又刺激上皮细胞生长。四、细胞对草酸盐晶体的应答研究显示，草酸盐不但可为结石提供适宜的环境从而促进晶体形成，该离子本身也可影响肾小管上皮细胞，使组织易于滞留晶体。特发性CaOx肾结石病人肾脏分泌反映细胞损伤的酶增加，这种损伤可能由离子化的草酸盐引起16，17。用各种致高草酸尿制剂处理大鼠也可使尿中肾酶增高。草酸盐对LLC-PK1细胞的生存力及生长的影响表现为浓度依赖性的双重作用。Scheid等8，19研究了不同浓度草酸盐对LLC-PK1细胞的作用，发现游离草酸盐浓度为140350mol/L时，细胞增生明显，且有胞浆空泡形成及核固缩现象；当游离草酸盐浓度大于350mol/L时，细胞数目减少，核固缩细胞增多，提示低浓度草酸盐是肾小管上皮细胞的分裂素，而高浓度草酸盐有明显细胞毒性作用。草酸盐可刺激LLC-PK1细胞的癌基因c-myc表达，用c-myc的反义寡核苷酸预处理细胞可阻断这一反应，证明草酸盐的促细胞分离效应是通过c-myc基因的表达而起作用。草酸盐可促进培养的肾小管上皮细胞分泌OPN，在BSC-1细胞系的培养基中加入COM晶体后，COM迅速与培养基中的OPN结合，1小时后培养基中OPN下降46%，而24小时后OPN净含量增加18%20。用Northernblot方法检测发现