整理)慢病毒稳转细胞株步骤

1、稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（具体信息见附录及质粒的扩增提取）（大肠杆菌-80保存2-3年，质粒-20保存2-3年，病毒液-80保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号以及抗性或荧光基因、gag基因5端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制力量的病毒载体。2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20保存，不行分装），一

2、种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌*也可直接从公司买来病毒液（-80封口膜封口冻存管保存，4保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率210 倍。有肯定细胞毒性，需要摸索浓度（110g/ml）7、无血清培育基：optimen8、贴

3、壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培育基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭亡 30min；保存在4其次天1、配管试剂加样量/l推举量/l、g合计A管PLKO.1/pCDH3206psPAX21pMD2.G2Opti200B管XTREME-GENE6206Op

4、ti200A+B混合室温静置20min2、加入2ml全培育基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培育基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培育液，共20ml（-80保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4过夜第六天1、4，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150l PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50l分装，-80保存。<二>慢病毒转染靶细胞前期预试验MOI（步骤同正式试验）（见

5、三2,直接订购病毒液时才需要）细胞种类DU145PC322RV1LNCaPRWPE-1MOI2422前期测病毒滴度（稀释法，还有一种qPCR法见资料）1、第一天：预备96孔板，每孔加入10000个293T，为每个病毒预备20个孔（稀释10个浓度，各2个副孔）。放入37，5%CO2培育箱中培育。2、其次天：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒预备10个1.5ml EP管，每管加入207µl培育液，往第一个管中加入23µl病毒原液，混匀后，吸取23µl加入其次个管混匀。依此类推，做十个稀释度（1010-8）。吸取96孔板中原有的培育基，

6、加入含稀释好的病毒液。并做好标记。3、第三天：换液4、第四天：观看结果并计算滴度在荧光显微镜下观看结果，并数出最终两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）/2/X孔的病毒液的含量（µl ）×1000。（前面算出的是没l病毒量，所以乘于1000）第一天：1、种板（12/24孔板）需其次天为50%-70%，大约12孔板1×105细胞种类种板数收获细胞数DU145PC322RV1LNCaPRWPE-1其次天1、预备病毒液（可在第一天做）：在冰上融解2、预备完全培育基和 Polybrene 混合物（1:1000-1:200

7、0稀释，终浓度在5-10g/ml之间），加入相应培育板中（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500l）3、加入浓缩病毒液（12孔板30l-50l）（假如是直接购买病毒液需依据MOI确定病毒液量加入病毒液，自己包的病毒可以）4、培育过夜，对polybrene毒性敏感的细胞在4-6小时候换液第三天1、对细胞进行换液第五天1、用药物进行稳定株的筛选（具体筛选药物依据载体内的基因定，用氨苄青霉素0.5g/ml-10g/ml）2、需设置空白对比（未处理细胞加入相同浓度氨苄青霉素，党对比全部死光为筛选周期）第六天之后（依据筛选周期）1、换液传代2、观看GFP报告基因确定转染效率，或用qRT-PCR确定

8、转染效率三、留意事项及学问点1、名词解释（1）病毒感染复数（multiplicity of infection MOI）：含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染2、慢病毒摸索时加入梯度（具体见自己的说明书）3、慢病毒的储存与稀释:可以将病毒临时放置于4 保存；如需长期保存请放置于-80（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） A病毒可以存放于-80 6个月以上；但假如病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 B反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中依据每次的使用量进行分装。4、慢病毒载体示意图1载体质粒（PLK

9、O.1 抑制载体，PCDH-GFP+puro过表达载体）：（1）5LTR：long terminal repeat即长末端重复序列，不编码蛋白质，但含有启动子，增加子等调控元件（2）包组信号：LTR-通过包装细胞的RNA聚合酶转录为RNA，通过信号起始包装（3）启动子、酶切位点和抗性基因（amp氨苄青霉素puro嘌呤霉素）（4）stuffer：目的基因插入位点（慢病毒载体可插入5kbp左右）（5）GFP：green fluorescent protein绿色荧光蛋白（6）WPRE：Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element 肝炎病毒转录后调控元件。转录后可形成三级结构，促进基因的表达（7）cPPT/CTS: 逆转录病毒顺式作用区域,其中该cPPT和CTS区域诱导三链结构（更新于2018.11）2包装质粒（1