2013用于鼻咽癌高效靶向诊疗的多肽脂质纳米探针研制

1、A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of theRequirements for the Degree of Doctor of Philosophy in SciencePeptide-lipid nanoprobes for the theranostics ofnasopharyngeal carcinomaPh.D.CandidateMajor Supervisor: Haiming Luo: Biomedical engineering: Prof. Zhihong ZhangHuazhong University of S

2、cience and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. ChinaMay, 2013独创性本人所呈交的是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明的内容外，本不包含任何其他个人或集体已经或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全本的法律结果由本人承担。作者签名：日期：年月日使用书本作者完全了解学校有关保留、使用的规定，即：学校保留并向有关部门或机构送交的复印件和，被查阅和借阅。本人华技大学可以将本的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等保存和汇编本。

3、，在年不。（请在以上方框内打“”）后适用本书。作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华技大学博士要*摘鼻咽癌是中国南方和东南亚等地域广泛流行的高度，具有发病部位隐蔽和易于发生远处转移的特点。远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要之一。目前化疗，但是有 30%以上的患者由对于局部晚期鼻咽癌主要使用以顺铂为基础的于发生远处转移而导致治疗失败，其 5 年总生存率仅为 25%-30%。抗 EGFR 单克隆抗体 Cetuximab但尚存在着人化疗可以一定程度提高复发或转移性鼻咽癌患者的总生存率，抗体（HAMA）反应导致的显著毒副作用问题。与小化疗药物相比，基于纳米载体的靶向具有延长的体内循环周期、提高

4、的利用率、增加的细胞内摄取能力等优点，并在一定程度上降低了的毒副作用。因此，研制高效的鼻咽癌靶向纳米，对转移性鼻咽癌的治疗具有重要的临床应用价值。本研究取得如下创新结果：（1）发明了一种八价多肽纳米荧光探针，可用于靶向多肽的在体评价，由此鉴定了一条鼻咽癌高特异性的靶向多肽（TTP）。具体方法是，将靶向多肽序列偶联到四聚体远红色荧光蛋白（tfRFP）序列的碳、氮两端，通过 tfRFP 成熟后的四聚化效应自组装形成一种八价多肽纳米荧光探针 Octa-FNP。在体荧光成像证实， 它对鼻咽癌 5-8F 皮下肿瘤具有高特异性的靶向能力、增强的富集能力和高对比度的肿瘤显像能力，因此利用 Octa-FNP

5、可以快速灵敏地评价多肽的靶向能力。本文利用此方法鉴定出一条鼻咽癌高特异性的靶向多肽LTVSPWY（TTP），并通过对 125I 标记的Octa-FNP 进行放射成像，同样发现其能够高效蓄积于肿瘤组织内；（2）发明了一种新型的同时具有鼻咽癌协同靶向增强能力和能力的多肽R4F-TTP。具体方法是将鉴定的TTP 多肽与两亲性 螺旋多肽R4F 亲水端进行偶联。荧光显微成像和流式细胞检测结果均证实，FITC 标记的 R4F-TTP 被 5-8F 细胞摄取的量是FITC 标记的TTP 的3.1 倍，是FITC 标记的R4F 的10.4 倍。此结果表明R4F-TTP多肽对 5-8F 细胞确实具有协同增强的靶

6、向能力。碘化丙啶（PI）染色结果证实，R4F-*基金资助：科学研究计划项目（2011CB910401）、自然科学基金项目（81172153）和科技支撑计划（2012BAI23B02）I华技大学博士TTP 对 5-8F 细胞还具有选择性能力。（3）研制了一种对鼻咽癌 5-8F 肿瘤具有高选择性靶向能力和良好治疗效果的超小粒径纳米颗粒。透射电镜和纳米粒度仪结果显示，NP-TTP 是一种直径约为11 nm 的球形纳米颗粒。流式细胞检测结果表明，NP-TTP 被 5-8F 细胞摄取的量是纳米颗粒 NP（不含多肽 TTP）的 20.5 倍，是 NP-scrTTP（scrTTP 为 TTP 的随机序列多肽

7、）的 3.0 倍。NP-TTP 表现出明显增强的鼻咽癌细胞特异性摄取能力，提示多肽TTP 被呈现在纳米颗粒的表面。整体荧光成像结果证实，近红外荧光DiR-BOA标记的 NP-TTP 能够高效蓄积于鼻咽癌 5-8F 肿瘤内，并有效地扩散到整个肿瘤组织中，DiR-BOA 的荧光信号在肿瘤组织与肝、肾等正常脏器之间具有极高的对比度。通过尾静脉连续两次隔天给药，NP-TTP 对 5-8F 肿瘤的生长抑制率为 88±7%，对5-8F-mRFP 转移性肿瘤也具有明显的抑制效果。NP-TTP 对肿瘤生长的这种抑制作用，被证明与其诱导细胞凋亡和自噬体形成密切相关。当 NP-TTP 同步装载后，表现出

8、更强的抑制鼻咽癌 5-8F-mRFP 肿瘤转移的能力，明显延长了实验小鼠的生存期。综上所述，本文基于四聚体荧光蛋白发明了一种八价多肽纳米荧光探针，鉴定了一条鼻咽癌高特异性的靶向多肽TTP。将 TTP 与两亲性 螺旋多肽R4F 偶联所形成的杂交多肽 R4F-TTP，不仅具有协同增强鼻咽癌靶向摄取和选择性的能力，还能脂质纳米颗粒形成及其功能。利用 R4F-TTP 形成的脂质纳米颗粒，具有鼻咽癌高对比度靶向成像的能力和极低毒副作用的靶向治疗效果。本研究为靶向和治疗性多肽的在体评价、肿瘤的靶向成像和诊断以及多策略治疗提供了新方法。：鼻咽癌，靶向多肽，荧光纳米探针，治疗性多肽，靶向治疗，纳米载体，协同靶

9、向，II华技大学博士AbstractNasopharyngeal carcinoma (NPC) is an epidemic malignant cancer in Southern China and Southeast Asia with hidden location and early distant metastasis, which results to its treatment failure as one of the main reasons. Cisplatin-based combination chemotherapy remains the main treatm

10、ent for locoregional advanced NPC, but over 30% of patients fail with local recurrent or distant metastases in the treatment and their 5-year survival rate is just 25%-30%. Anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibody cetuximab combined with chemotherapy improves the overall surv

11、ival of metastatic NPC patients to some extent but still with side effects induced by human anti-mouse antibody (HAMA) response. Compared with small-molecule chemothera- peutic agents, nanocarrier-based drugs can extend the half-time of drugs in the blood, improve drugs utilization and increase intr

12、acellular concentration of drugs but with low side effects. Thus, it is valuable in clinical applications for developing nanodrugs targeted NPC with high efficiency to treat metastatic NPC. The innovation results in this thesis can be summarized as follows.1) We develop an octavalent peptide fluores

13、cent nanoprobe (Octa-FNP) which can be used to evaluate peptides in vivo and utilize it to identify a NPC-targeting peptide TTP. This was accomplished by combining a tetrameric far-red fluorescent protein (tfRFP) as a scaffold with a tumor-targeting peptide to engineer an Octa-FNP. Whole-body imagin

14、g in vivo demonstrated Octa-FNP could specifically target 5-8F subcutaneous tumor with enhanced tumor accumulation and high-contrast tumor imaging which was valuable for assessing the targeting capability of peptides. We used the methods to identify a NPC-targeting peptide LTVSPWY (TTP), which could

15、 high efficiently accumulate in the tumor tissue when radioimaging with 125I-labeled Octa-FNP.2) We creat a novel NPC-targeting peptide R4F-TTP with synergistic enhancement and selective killing. It was designed by conjugating a tandem NPC-targeted peptide (LTVSPWY) with an amphipathic -helical pept

16、ide R4F. Confocal imaging and FACS analysis demonstrated the uptake of R4F-TTP by 5-8F cells after incubated 24 h is3.1-fold of TTP, 10.4-fold of R4F, indicating R4F-TTP exhibit a synergistic effect onIII华技大学博士enhancing the targeting to 5-8F cells. Propidium iodide (PI) staining further demonstrated

17、 the selective killing tumor cells of R4F-TTP.3) We develop a ultra-small nanocarrier for 5-8F tumors with high-specific targeting and significant therapeutic effects. Both transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) revealed NP-TTP with an average size of 11 nm and sph

18、erical structure. FACS analysis demonstrated the uptake of NP-TTP by 5-8F cells after incubated 3 h is 20.5-fold of TTP, 3.0-fold of R4F-scrTTP (scrTTP is the scramble peptide of TTP). The enhanced specific uptake of NP-TTP by 5-8F cells suggested that targeting peptide TTP was presented on the surf

19、ace of the NP-TTP. Whole-body imaging demonstrated NP-TTP loaded with near infrared fluorescent dyes DiR-BOA could be efficiently accumulated in the 5-8F-mRFP tumor and diffused into entire tumor tissue, which resulted in extremely high contrast between the tumor tissue and normal tissues, such as l

20、iver and kidney. When administered twice every other day by post-injection, NP-TTP achieved 88±7 % inhibition rate in subcutaneous growth of 5-8F tumors and significant higher survival rate when compared with PBS. The inhibition of tumor growth was demonstrated to be related with the induction

21、of apoptosis and autophagy formation by NP-TTP. When synchronized with curcumin, NP-TTP showed a strong preventive effect on 5-8F metastasis.In sumarry, we invented an octavalent peptide fluorescent nanoprobe based on tetrameric far-red fluorescent protein and used it to identify a target-specific p

22、eptide TTP for NPC. Conjugating the TTP peptide with an amphipathic -helical peptide R4F created a novel NPC-targeting peptide R4F-TTP, which not only synergistically enhance the target-specific cellular upatke by 5-8F cells and their selective killing, but only can control the formation of lipid na

23、noparticles and their function. The novel lipid nanoparticle could achieve high-contrast imaging in vivo and therapeutic effects for 5-8F tumors. This study provides new methods for the evaluation in vivo of therapeutic and targeted peptides,tumor-targeted imaging for diagnosis and multi-targeted th

24、erapies for cancer treatment.Keywords: Nasopharyngeal carcinoma, targeting peptide,fluorescentnanoprobes,therapeutic peptide, molecular targeted therapy, nanocarrier, synergistic targeting, curcuminIV华技大学博士目录摘要IAbstractIII11.11.21.31.41.522.12.22.32.42.533.13.23.33.43.544.1绪论鼻咽癌的诊疗现状(1)鼻咽癌的靶向治疗(4)的肿

25、瘤治疗(12)基于纳米基于仿 HDL 纳米颗粒(17)选题背景及本文的主要研究内容(20)肿瘤靶向多肽的评价与鉴定新方法引言(23)材料与方法(25)实验结果(35)讨论(44)本章小结(45)基于八价多肽纳米荧光探针的鼻咽癌放射成像引言(46)材料与方法(46)实验结果(49)讨论(55)本章小结(56)鼻咽癌靶向诊疗多肽及其脂质纳米颗粒的研制引言(58)V华技大学博士4.24.34.44.555.15.25.35.45.566.16.26.3致材料与方法(58)实验结果(64)讨论(79)本章小结(81)鼻咽癌靶向纳米的肿瘤治疗作用研究引言(82)材料与方法(82)实验结果(85)讨论(9

26、0)本章小结(91)结论与展望研究结果(92)主要创新点(93)展望(93)谢(95)参考文献(97)附录 1附录 2攻读学位期间、专利及获奖目录(111). (113)实验动物专业技术VI华技大学博士1绪论1.1鼻咽癌的诊疗现状，具有地域和种族性分布特点1。在中鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度，每十万人中就有 20 至国南方、东南亚、非洲北部和阿拉斯加等地域具有高50 例鼻咽癌患者2。鼻咽癌发病部位隐蔽、灶小，且与眼、耳、鼻、咽喉、颅底骨和脑神经等重要相邻，导致它很难进行手术治疗。而且它还易于较早地上行向颅底颅内侵袭，下行向颈部淋巴结转移或行远处转移至骨、肝、肺等组织，其早期症状复杂，局部症状不

27、明显，因此很容易造成误诊和漏诊。据Vokes 等新确诊的鼻咽癌中 75%-90%已为鼻咽癌局部晚期，且通常伴有颈部淋巴结转移或远处转移3。目前对于早期局部鼻咽癌率达到 64%-95%，而对于局部晚期鼻咽癌的率只有 44%-68%，因此需要对鼻咽癌进行早期诊断4。目前，对鼻咽癌最直接的早期诊断方法是使用鼻咽镜进行检查。它不仅易于对鼻咽部病变部位或肿瘤直接观察，还方便对鼻咽部肿块进行活检来进一步确诊。但是鼻咽镜不能对鼻咽部粘膜下或咽隐窝进行观察，具有 5%的漏诊率5, 6。为了确诊鼻咽部有无鼻咽癌的浸润和淋巴结转移，常用的影像学检查主要是 CT 和 MR7。CT 可以准确评价鼻咽部肿瘤的范围，清晰

28、显示难以被鼻咽镜检查发现的粘膜下浸润性生长的肿瘤，但是对鼻咽腔内微小的肿瘤却很难发现8。磁共振成像（MRI）对软组织具有极好的成像对比度，能清楚地显示鼻咽腔和咽旁间隙的病灶及其病理解剖状态，对早期淋巴结转移有明显的诊断优势5, 9。由于它在鼻咽癌的诊断、准确分期、放疗设野及治疗后随诊中的显著优势，现已成为鼻咽癌的首选影像学检查。对于淋巴结分期晚期和发生远处转移的鼻咽癌患者， 全身正电子发射断层显像（PET-CT）可以提供更加客观和准备的诊断10, 11。鼻咽癌对放疗和化疗都具高度敏感性，放疗是早期鼻咽癌的首选治疗方案。但是对晚期鼻咽癌，常采用 放疗和化疗的治疗方案12，因为放疗仅适用于肿瘤原发

29、灶及其前哨淋巴结转移的鼻咽癌治疗，而不适合远处转移灶的治疗。现在临1华技大学博士常采用的是一种调强放疗（IMRT）的治疗方法，它通过调节辐射光束，实现对肿瘤组织高剂量辐射的同时减少对正常组织的辐射剂量，从而减少放疗的毒副作用。这种放疗方法对局部鼻咽癌率可以达到 90%以上。有数据显示同步进行 IMRT和化疗，可以进一步降低治疗的毒副作用并提高 5 年总生存率13，但仍有 30%-40%局部晚期鼻咽癌患者由于复发或发生远处转移而导致治疗失败14。对于复发性鼻咽癌目前主要使用再次放疗外加局部手术的治疗方法，但放疗显著的毒副作用与鼻咽特殊的部位易导致患者出现治疗相关的并发症和潜在的功能性，其 5 年

30、总生存率只有 44%6, 9。尽管有研究者使用鼻咽镜切除术治疗复发性鼻咽癌，其 2 年总的生存率达到 80%以上15，但由于鼻咽癌恶性程度高，很难将病变部位完全切除而不复发16（如图 1.1 所示）。对于发生远处转移的鼻咽癌主要使用以顺铂为基础的化疗，最常用的是顺铂和 5-氟尿嘧啶，但是总的五年生存率只有 25%-30%17。因此需要发展有效的鼻咽癌靶向治疗是十分必要的。图 1. 1 头颈部鳞状细胞癌和复发。肿瘤区域与复发类型之间的关系。在最近的研究结果的基础上区域是由一个或多个粘膜区域具有癌相关或表型改变的上皮细胞组成。淡区域为单克隆细胞，没有浸润性生长或转移的行为，这是浸润性癌的标志。前病

31、变区域可能有不典型增生组织畸变特性，但不是必须的。临床暗示它可能是局部复发，也可能是第二 肿瘤手术切除后的初始癌16。Fig. 1. 1 Field cancerization and local relapse. The relationship between field cancerization and types of relapse is shown. On the basis of recent molecular findings, field cancerization is defined as the presence of one or more mucosal are

32、as consisting of epithelial cells that have cancer-associated genetic or epigenetic alterations. A precursor field (or field; shown in light blue) is monoclonal in origin and does not show invasive growth or metastatic behaviour, which are the hallmarks of an invasive carcinoma. A field is preneopla

33、stic by definition; it may have histological aberrations characteristic of2华技大学博士dysplasia, but not necessarily. An important clinical implication of a field is that it may be the source of local recurrences and second primary tumours after surgical resection of the initial carcinoma16.鼻咽癌的发病机制目前尚不清

34、楚，但普遍认为是由于遗传因素、和环境诱导交互作用造成的。其中遗传因素主要指鼻咽癌的性和易感性。中山大学肿瘤防治中心团队于今年发现 3 个新的散发性鼻咽癌易感，并证实人类白细胞抗原（HLA）与鼻咽癌发病风险的相关性，对实现高危人群的准确极具意义18。Epstein-Barr（EBV）是导致鼻咽癌发病的另一个致病因素19。鼻咽癌与 EBV 之间的关系最初通过血清学研究发现，后来通过在鼻咽癌肿DNA 及其细胞核抗原蛋白得到进一步证实20。由于鼻咽癌瘤细胞中检测到EB患者血清中EBV 抗体水平与健康者存在显著差异，因此 EBV 抗体及其DNA 已用于鼻咽癌的早期筛选和辅助诊断21。EBV后的鼻咽癌细胞

35、，其、和表型都发生了改变（如图 1.2 所示），如膜表面受体 EGFR、VEGFR，c-MET、Her-2 等表达显著增加3。图 1. 2 EBV 的导致鼻咽癌细胞的改变。AKT - 蛋白激酶 B，AP-1 - 激活蛋白 1，c-MET- 间质上皮过渡因子，cyclin-D1 - 细胞周期蛋白D1，EBV - Epstein-Barr，EGFR - 表皮生长因子受体，ETS1 - ETS1蛋白，HIF-1 - 缺氧诱导因子 1，LMP - 潜伏膜蛋白，NF - 激活的 B 细胞轻链增强核因，PI3K - 磷脂酰肌醇三激酶，STAT3 - 转录信号转导子与激活子和内皮生长因子3。VEGF -3华

36、技大学博士Fig. 1. 2 Molecular aberrations in NPC arising from EBV infection. AKT protein kinase B, AP-1 activator protein 1, c-MET mesenchymal epithelial transition factor, cyclin-D1 cyclin protein D1,EBV Epstein-Barr, EGFR epidermal growth factor receptor, ETS1 ETS1 family protein,HIF-1 hypoxia inducibl

37、e factor 1 alpha, LMP latent membrane protein, NF nuclear factorkappa light chain enhancer of activated B cells, PI3K phosphoinositide 3-kinase, STAT 3 signal transducer and activator of transcription 3 and VEGF vascular endothelial growth factor3.随着现在诊疗技术的进步，同步放疗与化疗对局部鼻咽癌的率可以达到94.9%，但鉴于目前治疗的局限性，鼻咽癌

38、总的五年生存率仍然只有 50%-70%17,22。而且由于传统的放疗和化疗缺乏肿瘤特异性，在取得疗效的同时也给患者带来很大13的毒副作用23。因此，需要探索更为有效的治疗降低转移率，从而进一步提高患者总的 5 年生存率。以提高鼻咽癌局控率、1.2鼻咽癌的靶向治疗随着生物技术在医学领域的快速发展和对发病机制研究的深入，人们认识到肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性和系统性疾病，它主要是通过癌突变、抑癌或表达调控失常而导致的。因此，选择与肿瘤相关的特异性作为靶点，利用靶标特异性抑制剂或对肿瘤进行选择性，从而避免对正常组织细胞的损伤，这种肿瘤靶向治疗的方法因其具有疗效高、副作用低的特点而成为近年

39、来肿瘤研究的热点。目前上市的肿瘤靶向主要有单克隆抗体和小化合物。1.2.1 EGFR 为靶点的靶向治疗由于 80%的鼻咽癌高表达表皮生长因子受体（EGFR），并且 EGFR 表达量的高低与鼻咽癌分期和临床不良预后是密切相关的24，因此EGFR 已成为鼻咽癌治疗的一个重要的靶点。目前抗EGFR 单克隆抗体西妥昔单抗（Cetuximab）和表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR-TKI）都已应用于晚期鼻咽癌的治疗25, 26。1.2.1.1 抗体偶联的单克隆抗体靶向治疗在肿瘤治疗方面已经展示了良好的临床应用前景。它可以直接靶向肿瘤表面抗原抑制肿瘤生长，也可以与放射性核素、或毒素形成偶联物，27（如图

40、通过抗体靶向到肿瘤细胞实现特异性1.3 所示）。西妥昔单抗（Cetuximab）是一种人鼠嵌合性IgG 单克隆抗体，于 2006 年被美国 FDA 批准用于4华技大学博士局部进展期头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的治疗。它通过与EGFR 胞外端高效、特异性地结合，竞争性地抑制 EGFR 受体与其配体的结合，阻断受体相关酶的磷酸化， 进而抑制肿瘤细胞生长，达到抗癌目的28。使用 Cetuximab 单抗与卡铂 治疗先期单独使用铂类化疗失败的复发或转移性鼻咽癌患者，其疾病响应率达到 12%，临床 率达到 60%，但具有很强的毒副作用29。一项临床随机研究发现，CetuximabIMRT 相比较单独的

41、放疗组显著延长疾病进程并提高总的生存率30。因此单抗西妥昔单抗可以增强传统化疗和放疗的效果，显著延长总生存率和疾病无进展生存期。图 1. 3 治疗性抗体的概念。（a）靶向肿瘤单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性直接杀死肿瘤细胞；（b）通过双特异性单链抗体或抗体的配体融合蛋白靶向细胞因子或免疫调节来免疫抑制肿瘤细胞。而且，抗体的配体融合蛋白可以诱导靶细胞及旁观者细胞凋亡；（c）通过将细胞毒性，毒素或放射性核苷酸与单克隆抗体进行偶联来杀死靶肿瘤细胞；（d）通过靶向肿瘤细胞的酶和到治疗肿瘤的目的27。Fig. 1. 3 Concepts of therapeutic anti

42、bodies. (a) Targeting monoclonal antibodies to the tumour can result in the destruction of the tumour cells by antibody-dependent cellular cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity. (b) Similarly, targeting cytokines or immunomodulatory molecules either by bispecific scFv or antibodyligand f

43、usion proteins to the tumour modulates the immune response against the tumour. In addition, antibodyligand fusion proteins can induce apoptosis to targeted cells as well as bystander cells. (c) A more direct approach to kill the targeted cell is the conjugation of cytotoxic drugs, toxins or radionuc

44、leotides to the monoclonal antibodies. (d) The antibody-directed enzyme prodrug therapy approach specifically aims at causing bystander effects by targeting enzymes to the tumour cell and delivering a prodrug that is converted to a chemotherapeutic by the targeted enzyme27.可转化为化疗的前药引起的旁观者效应来达5华技大学博士

45、1.2.1.2 小EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（gefitinib）是一种的苯胺喹唑啉化合物，可通过与 EGFR 胞内的酪氨酸激酶催化区域结合，选择且可逆性地抑制 EGFR 酪氨酸激酶的活性，从而阻断信号转导。它于 2003 年被美国 FDA 批准用于治疗化疗失败的晚期非小细胞肺癌（NSCLC），不少研究者认为它对鼻咽癌也具有很好的疗效。但 Hui 等研究者，gefitinib 对 379 个转移性鼻咽癌患者的治疗中，3 年总的生存率只有 37%。在一项鼻咽癌期临床研究中，gefitinib 治疗没有转移性的 19 个局部鼻咽癌患者，只有 2 例肿瘤有微小的收缩31。尽管复发和转移性肿瘤

46、的鼻咽癌患者对 gefitinib 具有很好的耐受性，但治疗率却很低。考虑到局部鼻咽癌患者的这种治疗结果，gefitinib 对鼻咽癌的治疗效果是值得怀疑的。因此，EGFR 靶点进行的鼻咽癌靶向治疗，EGFR-TKI 对于晚期鼻咽癌的治疗其疗效甚微，不推荐用于鼻咽癌的临床治疗。Cetuximab鼻咽癌患者有一定的临床效果，但副作用严重。Cetuximab卡铂对复发或转移性IMRT 或放化疗可以显著延长疾病进展时间和提高总的生存率，它可能成为局部晚期鼻咽癌治疗的新选择。1.2.2 VEGFR 为靶点的靶向治疗内皮生长因子受体（VEGFR）被证明在 40%-70%的鼻咽癌中高表达，并且与高的转移性

47、复发率和低的总生存率密切相关32, 33。它的过表达是由于 EB 病毒潜伏膜蛋白或核抗原结合到启动子位点的c-Jun 和转录激活因子 ATF2 上，增强激活蛋白 AP-1 转录因子的活性而导致的34, 35。因此可以通过抑制 VEGFR 实现鼻咽癌的抗生成治疗。目前鼻咽癌VEGFR 靶点进行的靶向治疗试剂有单克隆抗体贝伐单抗和小酪氨酸激酶抑制剂。尽管VEGFR 是鼻咽癌靶向治疗中一个很有吸引力的靶点，但在实际临VEGFR 靶点开展的鼻咽癌抗床中生成治疗并不多见。根据美国肿瘤放射治疗协作组(RTOG)最近完成的一项利用贝伐单抗局部晚期鼻咽癌的 II 期临床实验中，贝伐单抗的抗顺铂和5-氟尿嘧啶同

48、步放疗治疗生成治疗被证明是没有效果的36, 37。在另一项 II 期临床实验中，使用治疗 26 例复发或转移性鼻咽癌患6华技大学博士38。因此，者，中位进展时间为 1.8，中位总生存时间为 4.2鼻咽癌的抗生成治疗其临床效果目前是不乐观的，VEGFR 是否能作为鼻咽癌治疗的有效靶点，还有待临床进一步的评价。1.2.3 COX-2 为靶点的靶向治疗环氧合酶（COX）是参与的一个关键酶。它具有两种形式：COX-1素和COX-2。COX-1 在正常组织的细胞膜上进行组表达，而 COX-2 只在炎症和肿瘤发生过才被诱导产生，且它对肿瘤的发展具有重要的作用。体外和在体实验都证实，COX-2 与肿瘤生长、

49、转移、生成及其凋亡密切相关39。有研究表明，43%-75%的鼻咽癌患者都过表达 COX-2，并且它与淋巴结转移和不良预后密切相关39, 40。因此 COX-2 是鼻咽癌靶向治疗一个重要的靶标，塞来昔布（Celecoxib）是它的抑制剂。Liu 等，Celecoxib 可以部分通过抑制STAT3 磷酸化从而抑制鼻机制还有待进一步阐明41。临床研究咽癌细胞的增值并诱导其凋亡，但具体的中，Celecoxib 治疗过的鼻咽癌患者，其生成减少，且肿瘤转录相关表达水平都发生下调42。目前鼻咽癌COX-2 靶点进行的临床治疗还在进一步的评价中。除了EGFR、VEGF 及COX-2 的过表达与非转移性晚期鼻咽

50、癌的不良预后密切相关外43，还发现鼻咽癌也高表达c-MET、c-Kit 及Her-2 等，因此它们也可能成为鼻咽癌潜在的治疗靶标。从以上综述可知，目前只有 CetuximabIMRT 或放化疗，有可能成为局部晚期鼻咽癌治疗的新选择。但是 Cetuximab 为嵌合抗体，尚存在人抗体（HAMA）反应导致的毒副作用问题。而且，由于抗体量大，对肿瘤胞外基质穿透能力不够，使得大体积实体肿瘤的治疗效果仍不十分理想。利用工程将完整抗体改造为不同量大小的 Fab、scFV、二价抗体或重组片段（如图 1.4 所示），可以增加对肿瘤的穿透能力，但是相对于完整抗体，其亲和力大大减弱44。随着抗体与改造技术的进步，

51、越来越多的完全人源化抗体正在临床，免疫原性问题有可能会得到解决45。此外，由于抗体为异体蛋白，易被网状内皮系统摄取，易造成肿瘤的靶向给药量不足，影响其治疗效果。7华技大学博士图 1. 4 单克隆抗体和抗体片段。靶向抗体通常是免疫球蛋白G（IgG, A）或 Ig段（B-D）。F(ab )2 (B) 或 Fab (C)片段可以由完整单克隆抗体酶切形成也可以通过生物学技术克隆形成，例如 Fab，scFV，二价抗体或重组片段。通过传统杂交瘤技术的单克隆抗体是的，现在技术的发展可以 嵌合抗体、人源化或完全人源化的抗体或片段。VH，可变重链，VL， 可变轻链44。Fig. 1. 4 Antibodies

52、and antibody fragments. Targeting antibodies are normally monoclonal immune-globulin G (IgG) (Aa) or IgG fragments ( BD). F(ab )2 (B) or Fab (C) fragments can be made by enzymatic cleavage of the whole monoclonal antibody (mAb) (Aa) or by molecular biological techniques, for example, Fab (C), scFV (

53、Da), bivalent ( Db) or recombinant fragments (Dc). mAbs that are made from the traditional hybridoma technique are murine in origin. Recent developments have led to improved techniques for the production of chimeric, humanized or fully human antibodies or fragments (Abd). VH, variable heavy chain; V

54、L, variable light chain44.1.2.4 基于多肽的靶向治疗常见的化疗和放疗对肿瘤患者会造成的严重毒副作用，而抗体制剂又具有免疫原性和穿透力弱的缺陷，而多肽类因具有穿透力强、免疫原性低、毒副作用小的特点而受到广泛关注。不同的活性多肽对不同肿瘤作用机制不同，因此根据多肽进行抗肿瘤治疗的特点，可以将多肽分为抗肿瘤肽、抗菌肽及靶向多肽这三类。1.2.4.1 抗肿瘤肽肿瘤是多因素、多阶段的各种交互作用发展产生的，但最终都涉及到癌的表达和调控。抗肿瘤肽可以直接与肿瘤相关的和对肿瘤产生作用的调控因子特异性结合，从而抑制肿瘤 DNA、肿瘤新生生成和转移或诱导8华技大学博士肿瘤细胞凋亡。Dasgupta 等研究者利用蛋白激酶Raf-1 的部分多肽（ISNGFGFK）干扰 Raf-1 与成视网膜母细胞瘤蛋白 Rab 的结合，从而抑制 Rb 磷酸化、细胞增殖及VEGF 介导的毛细生成。而且在体实验证实该多肽处理过的肺癌 A549 皮下荷瘤鼠，其肿瘤体积缩小 79%，毛细数量减少了 57%46。强效的天然生长抑素（SST）类似物奥曲肽(octreotid)，是一种人工的环状八肽抗肿