干细胞内毒素检测标准操作规程SOP-ZK

1、干细胞毒素检测标准操作规程（SOP） 北京赛托森生物科技发展有限公司 质量管理 干细胞毒素检测标准操作规程 文件名：干细胞毒素检测标准操作规程 文件编号： 制定人： 日期：年月日 文件类型：工作标准 审核人： 日期：年月日 版次：第一版 批准人： 日期：年月日 印数：共5份 生效日期：年月日 颁发部门：质量管理 分发至：质量副总经理、质量管理部、QC检验室、综合办公室 变更记载 修订号 修订人 批准日期 生效日期 原因及目的 1简述 本操作程序主要参照BP2003AppendixXIVC.Testforbacterialendotoxins中 MethodA.Gel-clotmethod:li

2、mittestf口MethodB.Gel-clotmethod:semi-quantitativetesStM 中国药典2010版附录xHE细菌毒素检查法中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。 2.安全注意事项 由于细菌毒素对人体有毒害作用，且邕试剂对人的危害作用尚不明确。因此实验过程中一定要做好防护措施。 3检验目的 检验供试品中的的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定。 4检验原理 本操作程序通过邕试剂与毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量检测毒素。 5供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的

3、围。 对于过酸、 过碱或本身有缓冲能力的供试品， 需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌毒素检查用水在已去除毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含毒素和干扰因子。 1.1 试品细菌毒素的限伸L) 药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算法见各药典。 7供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定MVC) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允达到稀释的最大倍数1-MVD),在不超过此稀释倍数的浓度下进行毒素限值的检测。用以下公式来确加VD,MVD=cL/入。式中L为供试品的细菌毒素限值;c为供试

4、品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c为1ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度c=；WL;人为在凝胶法中邕试剂的标示灵敏度EU/ml(商品包装上有标示)。 举例：设设邕试剂白灵敏度为0.25EU/ml,即入=0.25EU/ml,英国药典规定柠檬酸的限值L为0.5IU/mg(IU与EU等同)，由于柠檬酸为固体，则可以通过c=入/L,确定最小有效稀释浓度，即MVC=0.25/0.5=0.5mg/ml8设备和试剂8.1电子天平 1.2 电热灭菌干燥箱，温度能达到250摄氏度

5、1.3 恒温水浴或恒温培养箱，能满足恒温在37tC 1.4 涡旋混合器 1.5 无菌工作台 1.6 微量加样器，200ul 1.7 去热源一次性吸头 1.8 凝集管(10mmX75mm) 1.9 管架 1.10 锡纸 1.11 邕试剂，应具有主管部门的批准文号。 1.12 细菌毒素标准品或细菌毒素工作标准品,除另有规定外， 应使用由中国药典生物制品检定所统一发放的标准品 1.13 细菌毒素检查用水，毒素含量应小于0.015EU/ml 1.14 细菌毒素检查用pH缓冲溶液 注：以上试剂推荐使用邕试剂实验厂有限公不度斯生物有限公司及博康海洋生物公司 1.15 器皿去热源 实验所用的器皿需经处理，取

6、出可能存在的外源性毒素。通常玻璃器皿首先细菌，再用锡纸包裹放入250c干燥箱中进行干热灭菌。而使用不耐热的塑料器皿，应选用表面无毒素并且对实验无干扰的器械。 1.16 试剂的灵敏度符合实验 在本检查法规定的条件下，使邕试剂产生凝集的毒素的最低浓度即为邕试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的邕试剂或试验条件发生了任可能影响检验结果的改变时,应进行邕试剂灵敏度复核试验。 细菌毒素标准溶液的制备 取细菌毒素标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75州精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶。按照标准品说明书，加入规定量的细菌毒素检查用水溶解

7、其容物，用封口膜将瓶口封，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌毒素标准溶液，即2.0入、0.5入、0.25入（入为所复核的邕试剂的标示灵敏度）,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。 待复核邕试剂的准备 取0.1ml成的邕试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核邕试剂的规格不是0.1ml成时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将邕试剂溶液混合在一起，然后每0.1ml分装到

8、10mmx75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 凝胶反应 将已充分溶解的待复核邕试剂18支（管）放在试管架上，排成5歹I，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2入、入、0.5人和0.25人的毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水（如图1）。加样结束后，将邕试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37ctC水浴或适宜恒温器中，试管架保持 水平状态，保温60i2分钟。 2XXQ5XO25入疆 1 2 3 4 图1 判定和计算邕试剂灵敏度的测定值入c） 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转

9、180观察，管形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-） 当最大浓度2人管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验为有效.按下式计算反应终点浓度的几乎均值,即为邕试剂灵敏度的测定值（入c）。kc=antilg（EX/4）,式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当入c在0.5入2人（包括0.5入2人）时，可用于细菌毒素检查，并以标示灵敏度人为该批邕试剂的灵敏度。 举例 设待复核邕试剂的灵敏度为0.25EU/mJ即入=0.25EU/mJ

10、实验结果如下： 00 0000 0000 0000 0.125 则： 入c=antilg（!2X/4） =antilg（lg0.25+lg0.5O+lg0.125+lg0.125/4 =antilg（-0.602-0.301-0.903-0.903）/4 =antilg（-0.508）=0.310（EU/mD 入c在0.5入-2入围，符合规定。 11干扰实验 干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对毒素和邕试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌毒素检查法提供依据。 制备毒素标准对照溶液 取1支细菌毒素标准品， 用细菌毒素检查用水稀释抽个浓度的标准溶液即2.0入、 入、0.5入、0

11、.25人。 制备含毒素的供试品溶液 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将1.1中的同支细菌毒素标准品稀释成4个浓度即2.0入、1.0入、0.5入、0.25人的含毒素的供试品溶液。 邕试剂的准备 取规格为0.1ml皮的邕试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%H精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核邕试剂的规格不是0.1ml皮时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的邕试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10X75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。 凝胶反

12、应 将准备好的邕试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0入、1.0入、0.5入、0.25人的毒素标准对照液,另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外18支（管）邕试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0入、1.0入、0.5入、0.25人的毒素的含供试品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照，如表1所示。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放入37cte水浴或适宜恒温器中，保温60

13、n分钟后，观察并记录结果。 表l凝胶法干扰试验溶液的制备 1编力 毒素浓度/被加入毒素的溶液 稀释用液 稀释倍数 所含毒素的浓度 平行管数 A 无/供试品溶液 2 B 2人/供试品溶液 供试品溶液 1 2人 4 2 1人 4 4 0.5人 4 (EU/ml) 0.50 0.250.125 0.062 Nc 1 + +- - 0.25 2 + - - 0.50 3 + +- 0.12 反应终点浓度X 毒素浓度 8 0.25人 4 C 2人/检查用水 检查用水 1 2人 4 2 1人 4 4 0.5人 4 8 0.25人 4 D 无/检查用水 2 注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C邕试剂标示

14、灵敏度的对照系列；D为阴性对照 判定并计算C和B的反应终点浓度的集合平均值E/口Et） 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在邕试剂灵敏度复核围时，试验为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几乎均值 （Es和Et）: Es=antilg（EXs/4） Et=antilg（EXt/4） 式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值dg）当Esft0.5入2入（包括0.5人和2入）及Et在0.5Es-2Es（包括0.5Esffi2ES时，认为供试品在该浓度下无干扰作用o若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不

15、超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理法能有效地排除干扰且不会使毒素失去活性，要使用预先添加了标准毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。 当进行新药的毒素检查试验前，或无毒素检查项的品种建立毒素检查法时,须进行干扰试验。 当邕试剂、供试品的处、生产工艺改变或试验环境中发生了任有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验 12凝胶限度试验 供试品溶液的制备 将供试品进行稀释，其稀释倍数为MVD并且已经排除干扰。 阳性对照溶液的制备 用检查用水将毒素标准品稀释制成2人浓度的毒素标

16、准液。 供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液或其稀释液将毒素标准品制成人浓度的毒素溶液。 阴性对照液 即细菌毒素检查用水。 邕试剂的准备 取规格为0.1ml皮的邕试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶。每支加入0.1ml检查用水溶解、轻轻转动瓶壁，使溶物充分溶解，避免产生气泡。若使用的邕试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将邕试剂溶液混和在一起,然后每0.1ml分装到105mm凝集管中，要求至少分装8管备用。 凝胶反应 取8支（管）溶解好的邕试剂，其中2支加入0.1ml供试品稀释液

17、作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管， 见表2。 将试管中溶液轻轻混匀后， 用封口膜封闭管口， 垂直放入37ctC水浴或适宜恒温器中，保温60n分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 表2凝胶限度试验溶液的制备 编号 毒素浓度/被加入毒家的溶液 平行管数 A 无/供试品溶液 2 B 2人/供试品溶液 2 C 2人/检查用水 2 D 无/检查用水 2 注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。 判定 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，

18、 供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性， 阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。 13.凝胶半定量试验 半定量实验是使用凝胶法估测供试品中毒素含量的法。系利用供试品系列与邕试剂反应的终点浓度计算出供试品中毒素的含量。 供试品系列的制备 用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释制备成1、2、4、8等浓度

19、，但最大稀释倍数不得超过MVD。 毒素标准系列的制备 用检查用水将毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2.0入、1入、0.5入、0.25Xo 供试品阳性对照溶液的制备 用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将毒素标准品制成人浓度的毒素溶液。 阴性对照液 即细菌毒素检查用水。 邕试剂的准备 取规格为0.1ml皮或分装好白邕试剂至少20支，其他操作按前文所述。 凝胶反应 将准备好的邕试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分别加入0.1ml的2.0入、入、0.5入、0.25人的毒素标准溶液，另一列2支（管）加入 0.1ml检查用水作为阴性对照。 另外8支（管）邕试

20、剂放在试管架上，排成4歹I，每列2支（管）。每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。另2支（管）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照，如表3。 表3凝胶半定量试验溶液的制备 编号 毒素浓度/被加入毒素的溶液 稀释用液 稀释倍数 所含毒素的浓度 平行管数 A 无/供试品溶液 检查用水 1 2 2 2 4 2 8 2 B 2人/供试品溶液 1 2人 2 C 2人/检查用水 检查用水 1 2人 2 2 1人 2 4 0.5人 2 8 0.25人 2 D 无/检查用水 2 注： A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。 从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。 B为2人浓度标准毒素的溶液A（供试品阳性对照）。 C为邕试剂标示灵敏度的对照系列。 D为阴性对照。 判定与供试品浓度CE的计算 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几乎均值在0.5