发酵学 第7章 发酵工艺的控制2

1、第五节 pH的影响及其控制 一、pH对发酵的影响 二、发酵过程中pH变化的原因 三、发酵pH的确定和控制 不同种类微生物，对不同种类微生物，对pHpH要求不同；要求不同；酵酵 母：母：pH 3.8pH 3.86.06.0细细 菌：菌：pH 6.5pH 6.57.57.5霉霉 菌：菌：pH 4.0pH 4.05.85.8放线菌：放线菌：pH 6.5pH 6.58.08.0一、pH对发酵的影响 同种微生物对同种微生物对pHpH变化的反映不同。变化的反映不同。 如，石油代蜡酵母如，石油代蜡酵母pH 3.5pH 3.55.0 5.0 生长良好，不易染菌；生长良好，不易染菌；pH 5.0pH 5.0时，

2、易染细菌；时，易染细菌；pH 3.0pH 7.5时，稳定性下降，时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。半衰期缩短，发酵单位也下降。 青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。定性有关。二、发酵过程中pH变化的原因在发酵过程中，在发酵过程中，pH值的变化决定于所用的菌值的变化决定于所用的菌种、基质的代谢，产物的形成，菌体自溶等。种、基质的代谢，产物的形成，菌体自溶等。 以产生利福霉素以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用pH值为值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现：三个出发值，结果

3、发现： pH值在值在6.8、7.5时，最终发酵时，最终发酵pH值都达到值都达到7.5左右，菌丝生左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；长和发酵单位都达到正常水平； pH值为值为6.0时，发酵中期时，发酵中期pH值只达值只达4.5，菌浓仅为，菌浓仅为20，发，发酵单位为零。酵单位为零。 这说明菌体仅有一定的自调能力。这说明菌体仅有一定的自调能力。 1.菌种遗传特性2.2.基质代谢基质代谢 （1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一上升，是补料的标志之一（2）氮代谢）氮代谢

4、氨基酸中的氨基酸中的-NH2被利用，被利用，pH下降；尿素被分解下降；尿素被分解成成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下降，当碳源不足时氮源当下降，当碳源不足时氮源当碳源利用，碳源利用，pH上升。上升。（3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降会上升或下降 如灰黄霉素发酵的如灰黄霉素发酵的pH值变化值变化: 如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢利用，丙酮酸堆积很少，利用，丙酮酸堆积很少，pH值维持在值维持在67之间；如以葡萄之间；如以葡萄糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使pH值下降到值下降到3.6，发酵单位，发酵单位很低。

5、很低。3.3.产物形成产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。变化。如有机酸类产生使如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。 4.4.菌体自溶菌体自溶 发酵后期，菌体自溶，发酵后期，菌体自溶，pH上升。上升。 此外，通气状况的变化，杂菌污染都可能引起此外，通气状况的变化，杂菌污染都可能引起发酵液发酵液pHpH的变化。的变化。引起发酵液引起发酵液pHpH值变化的常见因素值变化的常见因素(1)(1)下降下降 培养基中培养基中C/NC/N不当，有机酸积累；特别是

6、葡萄糖过量，或者中间不当，有机酸积累；特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累 消沫油加得过多；消沫油加得过多； 生理酸性物质过多；生理酸性物质过多；(2)(2)上升上升 C/NC/N比例不当，比例不当，N N过多，氨基氮释放；过多，氨基氮释放； 生理碱性物质过多；生理碱性物质过多； 中间补料时碱性物加入量过大；中间补料时碱性物加入量过大；发酵液的发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的值变化是菌体代谢反应的综合结果综合结果。从代谢曲线的从代谢曲线的pH值变化就可以值变化就可以推测推测发酵罐中的各种发酵罐中的各种生化反应的进展生化

7、反应的进展和和pH值值变化异常变化异常的可能的可能原因原因。确定和有效控制确定和有效控制pH在菌体生长或产物积累的最适范在菌体生长或产物积累的最适范围是高产的保证。围是高产的保证。三、发酵pH的确定和控制 1. 发酵发酵pH值的确定（范围，时间）值的确定（范围，时间） 原则：有利于菌体生长和产物的合成。一般根据实验结果确定。 随菌种和产品不同而不同。同一菌种，生长最适随菌种和产品不同而不同。同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。值是不一样的。 按发酵过程的不同阶段分别控制不同的按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH，使产，使产量最大。量最大。 生长

8、最适生长最适pH和产物形和产物形成最适成最适pH的相互关系：的相互关系： 两者相同，范围都两者相同，范围都宽；容易控制。宽；容易控制。 两者相同，范围都两者相同，范围都窄；必须严格控制。窄；必须严格控制。 两者相同，范围一两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。宽一窄；必须严格控制。 两者不同，范围都两者不同，范围都窄；分别严格控制。窄；分别严格控制。 最适最适pH值的确定：根据实验结果值的确定：根据实验结果 不同的不同的pH值出发进行发酵，发酵过程中定时测值出发进行发酵，发酵过程中定时测定和调节定和调节pH值以维持出发值以维持出发pH值，或者利用缓冲液值，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观

9、察菌体的生长情况，以配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的菌体生长达到最高值的pH值为生长最适值为生长最适pH。 同样的方法可测得产物合成的最适同样的方法可测得产物合成的最适pH值。但同值。但同一产物的最适一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。和培养条件有关。 确定发酵最适确定发酵最适pH值时，要考虑温度的影响。值时，要考虑温度的影响。最佳最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响pH对海藻糖水解酶产生的影

10、响对海藻糖水解酶产生的影响pH菌浓菌浓 pH酶活酶活 调节培养基的组分调节培养基的组分 适当调整适当调整C/NC/N比比及其它各组分比例及其它各组分比例，使，使发酵过程发酵过程中中pHpH变化在合适的范围内变化在合适的范围内 在基础料中加入维持在基础料中加入维持pHpH的物质的物质 如如CaCOCaCO3 3 或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等等 通过补料调节pH 在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH，如调节补糖速率，调节空气流量来调节pH 当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 氨水流加法：氨水流加法： 氨水可以中和

11、发酵中产生的酸，且氨水可以中和发酵中产生的酸，且NH4+NH4+可作为氮可作为氮源，供给菌体营养源，供给菌体营养. . 通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水( (浓度浓度2020左左右右) )，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。一次加入过多造成局部偏碱。 氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。故需避免使用铜制的通氨设备。青霉素的补料工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围(现已实现自动化)，其青霉素产量比用恒

12、定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25。 尿素流加法：味精厂多用，尿素首先被菌尿素流加法：味精厂多用，尿素首先被菌体尿酶分解成氨，氨进入发酵液，使体尿酶分解成氨，氨进入发酵液，使pHpH上上升，当升，当NHNH4+4+被菌体作为氮源消耗并形成有机被菌体作为氮源消耗并形成有机酸时，发酵液酸时，发酵液pHpH下降，这时随着尿素的补下降，这时随着尿素的补加，氨进入发酵液，又使发酵液加，氨进入发酵液，又使发酵液pHpH上升及上升及补充氮源，如此循环，致至发酵液中碳源补充氮源，如此循环，致至发酵液中碳源耗尽，完成发酵。耗尽，完成发酵。 这种方法既可以达到稳定这种方法既可以达到稳定pHpH值的目的

13、，又值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。产物合成的阻遏作用，提高产物产量。 采用补料的方法，可以同时实现采用补料的方法，可以同时实现补充营养补充营养、延长发酵周期延长发酵周期、调节调节pHpH值值和和培养液的特性培养液的特性( (如菌浓等如菌浓等) )等几个目的。等几个目的。 其它措施改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制

14、微生物代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低改变罐压及通气量，降低COCO2 2的溶解量。的溶解量。例例 pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液酵液pHpH下降，待有机酸被生产菌利用，下降，待有机酸被生产菌利用，pHpH上升。若不及时补糖、上升。若不及时补糖、(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4或酸，发酵液或酸，发酵液pHpH可迅速升到可迅速升到8.08.0以上，阻碍或抑制某以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。些酶系，使林可霉素增

15、长缓慢，甚至停止。 对照罐发酵对照罐发酵6666小时小时pHpH达达7.937.93，以后维持在，以后维持在8.08.0以上至以上至115115小小时，菌丝浓度降低，时，菌丝浓度降低，NHNH2 2-N-N升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。 发酵发酵1515小时左右，小时左右，pHpH值可以从消后的值可以从消后的6.56.5左右下降到左右下降到5.35.3，调节这一段的调节这一段的pHpH值至值至7.07.0左右，以后自控左右，以后自控pHpH，可提高发酵单位。，可提高发酵单位。pH7.0t不调不调pH调调pH效价效价pH例：克拉维酸发酵中例：克拉维酸发酵中pH变换控制变换控制问题：问题

16、：在在pH低时菌体生长受抑制，在高低时菌体生长受抑制，在高pH时克拉时克拉维酸要分解维酸要分解 用用2.52.5升罐进行的不控制升罐进行的不控制pHpH的发酵发现，前期由的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pHpH降至降至6.56.5。在达到最高细胞浓度后，在达到最高细胞浓度后，pHpH开始从开始从6.56.5升至升至8.38.3。CACA产产量达最高水平时，量达最高水平时，pHpH不再升高。在发酵终止时，不再升高。在发酵终止时，pHpH再再次升至次升至8.58.5。随着。随着pHpH升高，升高，CACA迅速分解。迅速分解。研究不同研究不同pH

17、对发酵的影响对发酵的影响分别配置分别配置pH为为6.0，7.0，8.0的培养基测定菌的生长的培养基测定菌的生长和产物合成和产物合成pH6.0时，生长受时，生长受抑制，抑制，CA产生被产生被抑制抑制,产物降解少产物降解少pH8.0时生长良好时生长良好产量低，产物降产量低，产物降解解pH7.0时的状况时的状况控制控制pH7.0pH7.0和和8.08.0时，最高细胞浓度接近相同时，最高细胞浓度接近相同( (约约1616PMV)PMV)，但控制，但控制pH6.0pH6.0时细胞生长受抑制。时细胞生长受抑制。在在2.52.5升生物反应器内，升生物反应器内，不控制不控制pHpH时时2.47g2.47g(m

18、L(mLh )h )控制控制pH7.0pH7.0时的产率时的产率3.37g3.37g(mL(mLh) h) 最高最高控制控制pH8.0pH8.0时，产率时，产率2.02g2.02g(mL(mLh) h) 在控制在控制pH6.0pH6.0时，时，CACA产生被抑制产生被抑制, ,但降解少但降解少因此对细胞生长和因此对细胞生长和CACA产生最好将产生最好将pHpH控制于控制于7.07.0，但，但在控制在控制pH7.0pH7.0时，仍出现时，仍出现CACA的迅速分解。的迅速分解。 由于由于CACA生产的最适生产的最适pHpH和减少和减少CACA分解的分解的pHpH各不相各不相同，因此在分批发酵中应用

19、了同，因此在分批发酵中应用了pHpH变换策略，使后期变换策略，使后期发酵发酵pHpH由中性由中性pH7.0pH7.0变换为酸性变换为酸性pH6.0pH6.0。 在发酵前期，在细胞生长和产生在发酵前期，在细胞生长和产生CACA期间控制期间控制pH7.0pH7.0，4d4d后，当后，当CACA产量达最高值时，变换产量达最高值时，变换pHpH为为6.06.0，以减少以减少CACA分解。最高分解。最高CACA浓度可保持浓度可保持24h24h。由于改变。由于改变pHpH，使，使CACA分解速率明显降低。分解速率明显降低。pHpH影响酶的活性影响酶的活性pH值影响培养基某些成分和中间代值影响培养基某些成分

20、和中间代谢物的解离谢物的解离pH影响发酵产物的稳定性影响发酵产物的稳定性 小小 结结发酵过程发酵过程pH会发生变化会发生变化基质代谢基质代谢产物形成产物形成菌体自溶菌体自溶菌种菌种发酵条件发酵条件pHpH的的控控制制方方式式Y调节培养基的组成调节培养基的组成Y在基础料中加入维持在基础料中加入维持pH的物质的物质Y通过补料调节通过补料调节pHY当补料与调当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调发生矛盾时，加酸碱调pHY改变发酵条件改变发酵条件第六节 溶氧的影响及其控制 一、溶氧对发酵的影响 二、发酵过程的溶氧变化 三、溶氧浓度的控制 溶氧是需氧发酵的重要参数 溶氧的大小对菌体生长和产物的性质及产量都会

21、有不同的影响。81216201520253035500mL三角瓶装液量/mL糖酸转化率/L-亮氨酸/gL-1L-亮氨酸糖酸转化率 发酵前期发酵前期，需氧量不断增加，此时需氧量超过，需氧量不断增加，此时需氧量超过供氧量，使溶解氧明显下降，摄氧率同时出现供氧量，使溶解氧明显下降，摄氧率同时出现一个高峰。一个高峰。 发酵中后期发酵中后期，分批发酵溶解氧变化较小，如不，分批发酵溶解氧变化较小，如不补加基质，发酵液的摄氧率与菌体的呼吸强度补加基质，发酵液的摄氧率与菌体的呼吸强度变化不大，供氧能力保持不变，溶解氧浓度变变化不大，供氧能力保持不变，溶解氧浓度变化也不大。化也不大。 当外界进行补料时，则溶解氧浓度就会发生变化，如当外界进行补料时，则溶解氧浓度就会发生变化，如补糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶解氧浓度补糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶解氧浓度下降，经过一段时间后又会逐步回升。下降，经过一段时间后又会逐步回升。 生产后期生产后期，呼吸强度减弱，溶解氧浓度也会逐，呼吸强度减弱，溶解氧浓度也会逐步上升。步上升。 生长过程从培养液中溶氧浓度的变