新药研发中药物分析方法建立与验证（课堂PPT）

1、1新药研发中药物分析方法建立与验证袁艳娟2015.04.1722022-3-72F分析方法的设计依据分析方法的设计依据F分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤F分析方法验证的内容与要求分析方法验证的内容与要求F药物分析应用示例药物分析应用示例内容提要内容提要32022-3-73第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据建立分析检测方法的主要依据 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 分析测定的目的与要求分析测定的目的与要求 生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法 实验室条件实验室条件42022-3

2、-74一、一、待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况准确测定准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物生物样品中的药物或其特定代谢物预处理预处理待测物待测物从结合物或缀合物中从结合物或缀合物中释放释放选择样品选择样品预处理方法预处理方法首先应考虑首先应考虑待测药物的待测药物的理化性质理化性质药物在生物体内的药物在生物体内的存在状况存在状况药物在生物体内的药物在生物体内的生物转化生物转化( (代谢代谢) )途径途径52022-3-75(一一)待测药物的理化性质待测药物的理化性质药物的药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法预处

3、理及检测方法具有具有亲脂性亲脂性在适当的在适当的pH值下用值下用溶剂萃取溶剂萃取具有具有强极性或亲水性强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取衍生化后萃取等等具有具有挥发性挥发性GC测定法测定法具有具有光谱或电化学特性光谱或电化学特性分析检测方法分析检测方法药物的药物的稳定性稳定性萃取浓缩技术萃取浓缩技术对酸碱不稳定对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂避免使用强酸或强碱性溶剂对热不稳定对热不稳定避免高温蒸发溶剂避免高温蒸发溶剂62022-3-76( (二二) )待测药物的体内存在状态待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低与血浆

4、蛋白结合的强弱及结合率的高低分离萃取方法分离萃取方法蛋白结合较强蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术分析检测技术浓度较低浓度较低（尤其有（尤其有代谢产物代谢产物共存）共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用采用LC-MS等分析检测技术等分析检测技术 72022-3-77二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求药代动力学药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢

5、产物血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物要求要求同时测定原形药物和代谢产物同时测定原形药物和代谢产物检测检测宽线性范围宽线性范围(CmaxCmax的的1/20)、高灵敏度高灵敏度(10-9g/ml)和高专属和高专属 性性(分离能力分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离原形药物及其代谢产物的分离)方法方法不必强调方法的简便、快速；不必强调方法的简便、快速；大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS 毒毒代动力学代动力学确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围820

6、22-3-78三、生物样品的类型与预处理方法三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定决定分析方法分析方法的应用的应用以血浆或血清为分析样品以血浆或血清为分析样品蛋白沉淀蛋白沉淀 溶剂萃取溶剂萃取分析样品较为分析样品较为“干净干净”，可用，可用HPLC或或HPLC-MS检测检测92022-3-79四、实验室条件四、实验室条件在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。器装备，合理选择可行的分析方法。102

7、022-3-710第二节第二节 分析方法分析方法建立的一般步骤建立的一般步骤 112022-3-711一、分析方法的选择一、分析方法的选择体内药物分析方法的设计体内药物分析方法的设计生物样品中的生物样品中的药物浓度药物浓度决定分析方法的决定分析方法的首要因素首要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少浓度低、样品量少难以通过难以通过增加取样量增加取样量提高方法灵敏度提高方法灵敏度通过通过选择适当的分析方法选择适当的分析方法适应样品分析需求适应样品分析需求122022-3-712二、分析方法的建立二、分析方法的建立 分析方法建立之前分析方法建立之前查阅

8、文献资料查阅文献资料充分了解药物在体内的充分了解药物在体内的动力学过程，动力学过程，使所使所拟定的分析方法拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定132022-3-713二、分析方法的建立二、分析方法的建立 初步拟定分析方法后初步拟定分析方法后进行一系列试验工作进行一系列试验工作选择最佳分析条件选择最佳分析条件同时同时验证分析方法的可行性验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品确认是否适用于实际生物样品F 分析方法的分析方法的建立建立和和验证验证过程过程是不可截然划分的是不可截然划分的 F 分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤

9、142022-3-714( (一一) )检测条件的筛选检测条件的筛选标准物质标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度检测灵敏度HPLC 调整检测器检测器(类型、条件) 色谱柱色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度) 流动相流动相(组分及其配比)及其流速 柱温柱温、进样量进样量、内标物质内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的足够的方法灵敏度方法灵敏度(LOQ) 良好的良好的色谱参数色谱参数(n、R、T) 适当的适当的保留时间保留时间(tR)152022-3-715( (二二) )分离条件的筛选分离条件

10、的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶剂试验空白溶剂试验 溶剂(方法特异性方法特异性)2空白生物基质试验空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性方法特异性)3模拟生物样品试验模拟生物样品试验 方法效能指标方法效能指标4实际生物样品测试实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性方法特异性)162022-3-7162. 空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质空白生物基质 (blank biological matrix)如空白血浆空白血浆 考察目标考察目标生物基质中内源性物质内源性物质对测定的干扰对测

11、定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号内源性物质信号172022-3-7173. 模拟生物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品模拟生物样品( (质量控制质量控制, ,QC样品样品) )空白生物基质中加入待测药物考察目标考察目标方法的线性范围线性范围、精密度与准确度精密度与准确度、灵敏度灵敏度 药物的萃取回收率萃取回收率等各项技术指标同时进一步进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性方法特异性182022-3-7184. 实际生物样品的测试实际生物样品的测试空

12、白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物代谢产物及其进一步的结合物结合物(或缀合物)实际生物样品实际生物样品确立分析方法后，确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试尚需进行实际生物样品的测试考察目标考察目标代谢产物代谢产物对药物、内标物质的干扰干扰情况进一步验证方法的可行性验证方法的可行性192022-3-719第三节第三节 分析方法分析方法验证的内容与要求验证的内容与要求验证步骤： 首先为分析方法分析方法的验证 特异性、精密度与准确度、回收率特异性、精密

13、度与准确度、回收率定量限与检测限、溶液稳定性定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中生物基质中待测药物稳定性稳定性的验证 室温放置、冷冻（或冷藏）、冻室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环融循环202022-3-720验证的效能指标与基本要求验证的效能指标与基本要求1特异性特异性避免干扰避免干扰2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围3准确度准确度与实际状况相符与实际状况相符4精密度精密度结果可重现结果可重现5定量限定量限达到峰浓度的达到峰浓度的1/101/206稳定性稳定性确保所有样品准确测定确保所有样品准确测定7提取回收率提取回收率确保准确度确保准确度 8.

14、基质效应基质效应 212022-3-721一、方法特异性一、方法特异性( (专属性或选择性专属性或选择性) )方法的特异性方法的特异性(specificity)系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力比较比较待测药物或其活性代谢产物待测药物或其活性代谢产物检测信号检测信号对照品（或标准品）空白生物基质模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）确证确证内源性物质对分析方法有无内源性物质对分析方法有无干扰干扰222022-3-722二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围标准曲线标准曲线（standard curve） calibr

15、ation curve or working curve标准曲线标准曲线用用模拟生物样品模拟生物样品建立建立线性范围线性范围(不包括不包括零点零点)应能应能覆盖全部生物样品覆盖全部生物样品中的药物浓度中的药物浓度不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度求算未知生物样品中的药物浓度建立标准曲线所使用的模拟生物样品建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质相同的生物基质制备制备232022-3-723 标准系列溶液的浓度范围标准系列溶液的浓度范围至少含至少含59个浓度点个浓度点(不包括零点不包括零点,即空白即空白)可可

16、覆盖全部待测生物样品中的药物浓度覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如：如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式等比梯度模式比例常数约为比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度为若体内平均达峰浓度为50，其，其1/20为为2.5设定最高浓度为设定最高浓度为100，最低浓度为，最低浓度为1 (个体差异个体差异)实际制备时：实际制备时：500、250、100、50、20、10 242022-3-724 标准系列模拟生物样品的制备标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质空白生物基质(如血浆如血浆)加入标准系列溶液适量，涡旋混匀加入标准系列溶液适量，涡旋混匀为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的

17、损失为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失先加入标准溶液先加入标准溶液 再加入空白生物基质再加入空白生物基质 涡旋混匀涡旋混匀 252022-3-725标准曲线的标准曲线的限度要求限度要求药代动力学或生物利用度研究药代动力学或生物利用度研究标准曲线至少包括标准曲线至少包括5个浓度个浓度(通常为通常为59个浓度个浓度,不包括零点不包括零点)最高浓度应高于达峰浓度最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于；最低浓度应低于Cmax的的10%5%，并应为方法的，并应为方法的LOQ(非非LOD)相关系数要求相关系数要求 0.99(色谱法色谱法) 低浓度点准确度为真实值低浓度点准确度为真实值8

18、0%-120%，其余点为，其余点为85%-115%。 262022-3-726三、准确度三、准确度方法准确度方法准确度(accuracy)系指用该方法系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度与其真实浓度的接近程度应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定272022-3-727四、精密度四、精密度方法精密度方法精密度(precision )系指每次测定结果与多次测定的平均值的系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度偏

19、离程度表示该分析方法的表示该分析方法的可重复性可重复性(reproducibility)反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法验证的基本要点之一性，是方法验证的基本要点之一实际生物样品的量有限实际生物样品的量有限(如血浆，一般为如血浆，一般为0.12ml)使用模拟生物样品测定使用模拟生物样品测定 282022-3-7281. 1. 表示方法表示方法方法精密度一般用标准偏差方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或或相对标准相对标准偏差偏差(relative standard deviation，RSD)表示表示 SD=RSD= =包括批内包括批内(wi

20、thin-run或或intra-assay)RSD日内日内(within-day) 和批间和批间(between-run或或inter-assay)RSD日间日间(between-day，day-to-day)112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniii292022-3-7292. 2. 测定法测定法分别测定法分别测定法()照准确度项下方法，取空白生物基质照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆如血浆)数份，分别在同一数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的个浓度的QC样品，并分析测定样品，并分析测定批内批内RSD每一浓度

21、每一浓度5个样品，每个样品测定个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分次，用随行标准曲线分别计算别计算3个浓度及每个浓度及每1浓度的浓度的RSD批间批间RSD每每1分析批内每一浓度制备分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定个样品，每个样品测定1次；用次；用随行标准曲线计算随行标准曲线计算3个浓度个浓度(每一浓度每一浓度3个分析批数据个分析批数据)的的RSD302022-3-7303. 3. 限度要求限度要求在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中对对 g/ml级水平的级水平的RSD一般应一般应10%ng/ml级水平的级水平的RSD一般应一般应15%在在LOQ附近附近R

22、SD应应20%。 312022-3-731五、定量限五、定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保证具有一定可靠性系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求准确度与精密度符合要求)的前的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度又称为方法灵敏度又称为方法灵敏度(sensitivity)标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点最低浓度点LOQ)要求要求 应能满足测定应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度个消除半衰期后生物样品中的药物浓度准确度在准确度在80%120%(或或RE在在2

23、0%的范围内的范围内)RSD20%322022-3-732六、稳定性与质量控制六、稳定性与质量控制稳定性稳定性包括方法稳定性和样品稳定性包括方法稳定性和样品稳定性方法稳定性方法稳定性方法的耐用性方法的耐用性样品稳定性样品稳定性生物样品的存放条件和时间、冻生物样品的存放条件和时间、冻-融循环融循环测定法测定法QC样品穿插于实际样品测定全过程样品穿插于实际样品测定全过程模拟模拟(或实际或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察要求要求 准确度准确度85%115%(RE在在15%范围内范围内)，RSD15%332022-3-733七、提取回收率七、提取回收率生物样品的预处理方法生物样品的预处理方法提取回收率，提取回收率，70%取空白生物基质取空白生物基质(如血浆如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓个浓度的度的QC样品样品(每一浓度至少每一浓度至少5个样品个样品)，每个样品分析测定，每个样品分析测定1次次另取等量的相同另取等量的相同3个浓度的含药血浆，经提