蛋白质工程及其应用示例

1、精选优质文档-倾情为你奉上蛋白质工程及其应用示例摘要：在论述蛋白质工程的基本概念和由来的基础之上, 介绍了蛋白质工程的主要内容，并着重阐述了蛋白质工程在工业用酶、食品行业和生物制药三个方面中的应用和前景。关键词：蛋白质工程；简介；发展与应用；1.蛋白质工程的概念和由来 蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础的学科，其主要通过、和的手段进行或，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。蛋白质工程最早始于1975年美国C. A. Hutehison使用了J. Lederberg 1960年推荐的寡脱氧核糖核普酸作为体外诱变剂，经他重新确定此诱变

2、剂的顺序，成功地实现了定位突变试验，培育出了具有各类生物学特性的突变株1。而蛋白质工程的命名是1981年由美国的K.Ulemer确定的2。继后，许多大学及著名的实验室以及经营生物工程高技术产业的公司大量投资竞相研究与开发。2.蛋白质工程的基本途径 从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸（基因）3.蛋白质工程的基本原理基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造生物新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通

3、过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“ 突变型” 蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。4.蛋白质工程的研究内容4.1 蛋白质结构分析 - 基础蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有的生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展， 但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质(几毫克几十毫克)，制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。对子哪些很微量的蛋白质来说，是

4、比较困难的。另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的。肤链结构，这种方法绕过了结晶、X一射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。 现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发具有高度专一性的药用蛋白质

5、。4.2 蛋白质结构、功能的设计和预测 - 基础的应用与验证 根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肤链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在的两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。目前，正加紧这方面的工作。虽然尚在起步阶段，但在可预见的将来， 建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。4.3 蛋白质的创造和改造 - 最终目标

6、蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法: 对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质链官能团，分割肤链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法: 使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖昔酶、酚酶、酸酶等去除或连接不同化学基团，利用转酞胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用. 缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成D N A，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肚键连接而成的肤构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质

7、的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代， 这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标D N A 明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。4.3.1 定位突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性和催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基

8、因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M 13，制得单链模板，人工合成一段寡核昔酸(其中含一个或几个非配对碱基)作为引物，合成相应的互补链，用连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌， 双链分子的胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。4.3.2 盒式突变1 98 5 年wels提出的一种基因修饰技术 盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶

9、消化基因，再用合成的发生不同变化的双链D N A 片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因3。4.3.3 PCR技术DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。以研究基因为模板，用人工合成的寡核昔酸(含有一个或几个非互补的碱基)为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效4。4.3.4 高突变率技术 从大量的野生型背景中筛选出突变型是一项耗时、费力的工作。有两种新的突变方法具有较高的突变率，(1)硫代负链法: 核昔酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物( a -( S )-d c T P ) 对

10、某些内切酶有耐性，在有引物和( a -(S )-d c T P ) 存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核昔酸外切酶l 从3 5 扩大缺口并超过负链上错配的核昔酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因；(2)UMP正链法: 大肠肝菌突变株RZ10 32中缺少脉嗜咤糖昔酸和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脉嗜咤( U )替代胸腺嗜咤( T )掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠肝菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制3。4.3.5 蛋白质融合 将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质

11、基因的片段组合在一起。经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。5.蛋白质工程的应用示例5.1在工业用酶中的应用5.1.1脂肪酶 脂肪酶能催化酯的水解和合成，广泛用于洗涤剂的生产，油脂工业，有机合成，皮革及造纸工业。Beer等人5根据酶的X-射线结构建立一模型，并通过定点突变搞清楚了Rhizopus oryzea脂肪酶的催化机制。Okkels等人6通过定点突变使Candida Antarctica A脂肪酶的比活力提高了4倍。Yamaguchi等人7将

12、Cys 二硫键引入Humicola lanuginsa 脂肪酶中，突变体的热稳定性提高了12，酶的最适温度提高了10。Patka 等人8发现Candida Antarctica B 脂肪酶的M72L突变体抗过氧辛酸氧化作用能力比野生型强。Kampen 等人9研究了Staphylococcus hyicus脂肪酶的突变体对底物专一性的影响，发现把356位的Ser用Val来替换，其磷脂酶活性降低了12倍。Egmond 等人10研究了Fusarium solani pisi 角质酶对阴离子的亲和性。发现过N172K突变，酶表面带有更多的正电荷，同野生型角质酶相比，突变体稳定性更差。在17和196位引

13、入负电荷残基，则酶对阴离子表面剂活性剂十二烷基磺酸锂的稳定性提高。Pseudomonas glumae脂肪酶的154和150位的氨基酸残基用Pro替代，在P1位引入Arg 残基，酶的抗蛋白稳定性得到了提高。5.1.2纤维素酶 纤维素酶现在已广泛地应用于医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。大多数工业用的纤维素酶都是葡萄糖苷内切酶，含有一个催化区和一个纤维素连接区。没有纤维素连接区则酶对于纤维素的活性很低。现在研究的重点是了解酶的吸附和活性之间的关系。有人对纤维素酶和蛋白酶进行了对照研究，发现纤维素酶的活性与吸附的强弱关系更

14、大11。Koivula 等人12对 Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶催化区域169 位的氨基酸残基Try 进行了研究，发现其能协助葡萄糖环转换成更容易反应的构形。Hakamada 等人13用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的Glu137、Asn179和Asp194 突变为Lys，其热稳定性得到了提高。Zhang 等人14专门研究了T.fusca 纤维素酶Ce16A表面残基对底物专一性的影响，发觉突变体R237A 对羧甲基纤维素的活力提高了。后来他15又研究了靠近活性位点残基对催化活性、底物专一性、配基连接亲和性的影响，4个残基（His159、Arg237、 Lys259、G

15、lu263）的7个突变体对羧甲基纤维素的活性都有所提高，其中K259H 突变体的活性提高的最为显著。5.1.3淀粉酶淀粉酶的使用范围极广，种类繁多，根据不同的需要可以选择不同种类的酶。-淀粉酶主要用来生产麦芽糖糊精，葡萄糖淀粉酶催化糊精可得到葡萄糖，用-淀粉酶可以得到麦芽糖，用葡萄糖异构酶可以将葡萄糖转化为果糖。而一般的淀粉酶催化都是在高温条件下进行的。应用蛋白质工程可提高酶的热稳定性。有人得到B. Licheniformmis -淀粉酶的双突变体A209V/H133T，酶在90的半衰期延长了9 倍。Mitchinson等人用定点突变和高通量筛选的方法得到了一个突变体，其最适pH 值提高了0.

16、51.0。Gloria等人16用Phe 或Tyr来替换B.stearothermophilus -淀粉酶289 位的Ala，其具有了催化醇化反应的能力。Sierks 等人17报道了通过改变葡萄糖淀粉酶活性位点的三个氨基酸残基，其作用于1，4-糖苷键相对于1，6-糖苷键的K cat/Km 比值提高了300倍。5.2在食品工业中的应用5.2.1葡萄糖异构酶的蛋白质工程1992年，Mrabet等人构建了密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶的突变酶K253R，其酶活是野生型的120，在60.lmolL葡萄糖底物存在下。它的热失活半衰期比野生型酶提高了5倍18。T Jibeurgh等人构建的密苏里游动放线菌葡萄

17、糖异杓酶的突变酶E185Q明显改变了酶的最适PH值，而且，与野生酶在Mn2+作用时的活性相比。E185Q要高出两倍19。另外，美国Amgen公司曾对大脑杆菌葡萄糖异构酶进行了盒式突变，筛选到两个活性大于野生型的突变酶20。葡萄糖异构酶的蛋白质工程是国家“863”计划资助项目，中国科学技术大学生命科学学院在这方面做了大量的研究工作，构建了多种性能改善的突变酶21-25，如朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Glyl38)为目标氨基酸后，用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行体外定点诱变，以脯氨酸(Pr01 38)替代Glyl38，含突变体的重组质粒在太肠杆菌中表达，结果突变型葡萄糖异构酶比野生型的热失活

18、半衰期延长一倍；最适反应温度提高1012；酶比活相同26。5.2.2细菌素的蛋白质工程27-32 细菌素是很有潜力的天然食品防腐剂，而细菌素生化和分子水平上的深入研究为细菌素蛋白质工程开辟了新前景。研究表明，即使在三维构象未知的情况下，某些小分子蛋白(如Lantibiotics)或疏水肽的蛋白质工程也是可行的。由于它们的氨基酸残基数目较少，使得定点突变和随机突变简单易行，对其进行一、二级结构水平上的预测及相关小肽的比较分析亦可获得许多重要的结构信息，有望建立特异性突变方法创造出“嵌台”细菌素。另外，因其分子量较小，适合于肚二维核磁共振技术研究其二级、三级空间结构及在不同溶剂中的溶液构象。应用蛋

19、自质工程改造细菌素通常有两类方法，一类是着眼于对细菌素结构与功能关系的深人理解，旨在创造出新的细菌素；另一类是改进现有的细菌素特性以适合于工业生产与应用。未来的细菌素蛋白质工程将主要从以下几方面着手：提高细菌素产量；改进细菌素溶解性能及在靶位系中的扩散性；提高细菌素的稳定性；拓宽细菌素的抑菌谱；提高细菌素抑菌比活力及研究细菌素的免疫等。在确定出要改造的氨基酸残基后，还需有合适的系统使突变的细菌素高效表达。5.3在生物制药中的应用 目前蛋白质工程通过在分子水平上进行设计以及DNA重组对自然界的蛋白质进行突变重新合成，在生物药物的开发中应用非常广泛33。蛋白质工程技术对药物合成做针对性的改造能够对

20、药物的稳定性、活性、生物利用度以及半衰期做进一步的优化。在生物药物的研究开发领域中具有重要的应用价值34。现主要对定点突变工程技术和体外定向转化技术在药物开发中的应用情况做相应的综述。5.3.1定点突变工程技术定点突变是根据生物医药的结构和功能进行针对性的改造，包括活性基团、DNA序列以及特定的核苷酸片段，做特定的插入或者删除，从而改变生物大分子的氨基酸序列，对药物的性状进行改变，在生物药物的编码序列以及一级结构中起着很好的修饰作用35。其与自然因素、化学因素诱导的突变相比特异性更强，同时可重复性强。通过改变相应的核苷酸序列对生物医药的功能和性质起作用，进而得到具有高活性的改良生物药物。纳豆激

21、酶是一种由纳豆枯草杆菌生产的具有溶解纤维蛋白活性的酶，在心血管药物的开发中具有较高的价值。纳豆激酶在实际应用中其稳定性较差，并且极为容易被氧化，对其进行定点突变，在序列中引入丝氨酸和丙氨酸，并改变其相应的催化残基以及附近的苏氨酸位点，成功让其在大肠杆菌中高表达，并且抗氧化测试显示抗氧化能力明显增强36。另外还可通过催化抗体从而对免疫球蛋白的活性进行调节，结合相应的突变技术将其催化酶活性进行提高，从而促进相应的酶解反应。采用PCR法进行定点突变也可改变核苷酸序列，结合包涵体对蛋白进行特异性的变性和复性处理能够纯化蛋白质的同时提高其生物活性37。5.3.2体外定向进化技术定点突变技术主要针对天然蛋

22、白的少数位点突变，蛋白质的高级结构没有显著变化，同时蛋白质的功能只是部分发生变化。但是对蛋白质的结构和功能做少部分改变并不能满足人们对蛋白质功能的认知。因此在蛋白质的结构和功能改造中进行体外分子定向转化有很好的应用价值38。蛋白质工程技术中体外定向转化也称作分子进化，通过体外的PCR、DNA技术对蛋白质工程涉及药物进行高通量筛选后对活性较高的药物进行筛选，从而得到自然界没有的品质优良的药物。其与定点突变不同的是在药物结构和功能方面不需要已知信息，因此也称作非理性设计。对于容易错误的PCR进行体外扩增时结合适当条件，使得碱基出现误配等突变，是一种简单、快速的随机突变，因此需要结合其他技术进行筛选

23、。通常在一轮定向筛选和选择后很难得到满意结果，因此需要对连续突变进行筛选。一次次在错误中筛选出相应的有益突变基因，从而在随机诱变中得到有益累积突变39。例如1，3-丙二醇在医药领域中可作为聚酯、聚醚以及聚氨酯的合成单体，在合成过程中相比于采用1，3-丙二醇氧化还原酶，同工酶的活性更高，同工酶是通过突变筛选得到的突变体氧化还原酶，其在很多其他醛类的反应中也有较强的催化活性。另外结合抗原决定簇的化学基团以及环氧化物中间体等对药物的结构进行调节能够提升其生物活性。DNA改组是对一些同源但有部分差异的基因序列打碎呈小片段后进行随机重组，在此过程中利用重叠碱基进行随机配对后形成重组全长核酸序列，并且结合

24、自然界的模拟对DNA进行重组筛选。DNA重组技术在酶和蛋白药物的改良和优化中运用较为广泛，其对酶的活性、稳定性以及特异性都有很好的筛选40。例如丙酮酸的工业和医药运用中采用乳酸氧化酶对D，L-乳酸进行氧化制得。为提高其热稳定性对乳酸氧化酶基因进行改组，得到其突变体，其半衰期和热稳定性都得到很大的提高。6.结语蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就, 它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代, 为蛋白质和酶在工业、农业, 特别是在医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要

25、的蛋白质的新时期。蛋白质本身的多样性为其多种应用创造了条件, 而随着蛋白质工程的发展, 在不久的将来又会有一大批人工创造的新蛋白质家族出现。总之, 蛋白质工程对于探索者确是一块沃土, 在付出必要的劳动之后, 一定会结出丰硕的果。参考文献：1 Hutehison C、A . 等:J、Biology chemistry1975, 263, 6551.2 U-emer. K .Science1955, 219, 666.3 Wiiliams DF. Mechanisms of biodegradation of implantable polymers. Clinical Materials,199

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