第七章离体授粉

1、第七章 离体授粉1离体授粉的概念和种类1.1离体授粉的概念离体授粉（pollination in vitro）是指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方法授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，又称为离体受精（fertilization in vitro）或试管受精（test tube fertilization）。1.2离体授粉的种类根据无菌花粉授于离体雌蕊的位置，可将离体授粉分为离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉三种方式（图71）。进行离体授粉时，从花粉萌发到受精形成种子以及种子萌发和幼苗形成的整个过程一般均是在试管内完成。图71离体授粉3种方式示意图(引

2、自Razdan，1993)离体柱头授粉 离体柱头授粉是指通过雌蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子和果实的技术(图71a)。离体柱头授粉的方法通常是在花药尚未开裂时切取母本花蕾，消毒后，在无菌条件下用镊子剥去花瓣和雄蕊，保留萼片，将整个雌蕊接种于培养基上，当天或第二天在其柱头上授以无菌的父本花粉。离体柱头授粉是一种接近于自然授粉的试管受精技术，先后在烟草、金鱼草、玉米、小麦等植物上获得了成功。1.2.2离体子房授粉通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行正常受精，最后获得具有生活力的种子，这一技术又称为子房内授粉(intraovarian pollina

3、tion)。把花粉直接送人子房，实现受精作用是克服受精前障碍的有效途径。子房内授粉可分为两种类型，即活体子房内授粉和离体子房内授粉。1.2.2.1活体子房内授粉活体子房内授粉是指被授粉的子房并不离体，仍然在活体植株上，对其用花粉悬浮液进行授粉，使活体子房发育并形成成熟种子的过程。整个操作步骤包括：确定供试植物的开花和花药开裂时间；对母本花蕾去雄并套袋；采集父本花粉；确定适于父本花粉萌发的溶液；将花粉引入子房。 花蕾去雄后12d即可将父本花粉引入活体母本的子房中。花粉粒引入子房中的方法有两种：一是直接引入法，即用锋利刀片在子房壁或子房顶端上开一切口，把花粉从切口处送进子房；二是注射法，即用lOO

4、mgL的硼酸将花粉粒配制成悬浮液，每滴悬浮液含100300个花粉粒。母本开花后，将子房用酒精棉进行表面消毒。在子房两侧彼此对应的位置上钻两个小孔，用注射器由一个小孔向子房内注入花粉悬浮液，子房内的空气则由另一个小孔排出，悬浮液要注满子房腔，直到开始由另一小孔中流出为止，注射完毕后，将两个小孔用凡士林封闭。这种子房内授粉方法在虞美人、罂粟、花菱草等植物中已获得成功。.2离体子房内授粉离体子房内授粉是指用无菌花粉对离体培养的子房进行授粉，使其发育成为成熟种子的技术(图7-1b)。取即将开花的花蕾，经过表面消毒，剥离花萼和花瓣，去掉柱头和花柱，在试管中将异种无菌花粉授于子房顶端的切口处，或将异种无菌

5、花粉引入子房内(引入方法同活体子房内授粉)，从而实现受精过程。Inomata(1979)进行两性不亲和物种油菜和甘蓝的种间杂交中，利用离体子房内培养方法成功地获得了杂种。1.2.3离体胚珠授粉离体胚珠授粉是指离体培养未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最终在试管内结出正常种子的技术(图7-1c)。离体胚珠授粉既可以将胎座上切下的单个胚珠(裸露胚珠)接种在培养基上，然后撒播花粉于胚珠表面，实现受精；也可以将带有完整胎座或部分胎座的胚珠接种在培养基上，并撒播花粉进行受精。在实际应用中，活体子房内授粉适用于子房较大的植物，因为这种方法能使花粉萌发后不需经过柱头和花柱组织进入子房，克服柱头和花柱组织上出现的

6、两性不亲和性。但这种方法仍然是在原植物体上进行的，对子房易脱落的植物不适用。离体柱头授粉由于从授粉开始到果实成熟都是在试管内进行，同时培养基组成和培养条件也可控制，解决了子房脱落和因胚乳发育不良使胚败育等问题。但由于整个受精过程仍然是通过柱头进行，所以不能克服因柱头和花柱组织造成的不亲和性的障碍。离体子房和胚珠授粉具有较大的优越性，因这两种方法是将花粉直接授于子房或胚珠上，整个受精过程都是在人工控制的试管里进行的，所以它既可排除柱头和花柱组织对于受精的障碍，又可克服活体子房的脱落。2离体授粉的意义 有性杂交是常规育种的一个主要手段，通过这个手段，植物育种家不仅能把同一物种不同品种的性状结合在一

7、起，而且还能把同一属不同种的性状结合在一起(远缘杂交)，从而创造出优良的植物新品种或新类型。有性杂交的做法是，在控制的条件下，用选定父本的花粉人工授给母本柱头。在被子植物中，包含着卵细胞(雌配子)的雌配子体长在子房腔内，受到子房壁和珠被的严密保护。正常情况下，花粉落在柱头上以后，与柱头相互作用而萌发，由萌发孔长出花粉管，花粉管穿越柱头和花柱组织进入胚珠以后，在卵细胞附近释放出2个精子，1个与卵细胞结合形成合子，另1个与2个极核融合形成初生胚乳核。 在自然界，一个柱头可能接受到各种各样的花粉，但并非所有落在柱头上的花粉都能参与受精作用。柱头和花柱所具有的特殊机制，保证只有门当户对的花粉才能正常地

8、发挥功能（亲和性），其他花粉则被拒之门外。因而，当把一个亲本的有生活力的花粉授给另一个亲本的柱头时，并不一定就能受精。造成受精障碍的因素包括：花粉在柱头上不能萌发；花粉管不能进入胚珠，造成这种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子房已经脱落；花粉管在花柱中破裂。以上这些都属于受精前障碍（合子期前障碍）。在另外一些情况下，即使受精能正常进行，但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育不良，杂种胚不能发育成熟。这是属于受精后障碍。因受精后障碍而导致远缘杂交的失败，可采用胚培养或子房培养或胚珠培养予以克服。而远缘杂交的受精前障碍的克服，可采用消除柱头和花柱的障碍，把花

9、粉粒直接送入子房，让花粉直接与胚珠接触，从而实现受精并使种子得到发育和成熟。这就是离体授粉的意义。为了达到这个目的，20世纪60年代初期，在完全人为控制的条件下进行了离体授粉(pollination invitro)技术的研究，先后在许多植物上取得了成功。3离体授粉的方法3.1试验材料的选择在进行离体授粉实验时，最好选用子房较大并有多个胚珠的植物，如茄科、罂粟科、石竹科的植物等。在这些植物中，其胎座上着生成百个胚珠。由于数量大，在分离过程中会有许多胚珠完好无损，授粉后容易进一步发育。上述几科植物的花粉也易于在胚珠上萌发，花粉管能大量在胚珠和胎座上生长。在单子叶植物中，最先获得成功的是玉米的离体

10、子房授粉，后来离体胚珠授粉也获得成功。由于剥除玉米子房壁获取裸露胚珠时，易造成胚珠损伤，可用刀片将未授粉玉米果穗上的子房上部13切除，使胚珠外露。这种方法操作简便，在技术熟练情况下不易伤害胚珠，而且能在短时间内得到大量正常发育的玉米胚珠。不论离体柱头授粉还是胚珠授粉，多保留母体花器官组织有利于离体授粉的成功。如在小麦离体柱头授粉中，保留颖片有利于子粒发育；在水稻试管受精中，可用尚未开花的稻穗作温汤去雄(45，5min)后，将父本花药塞人母本的颖花中，然后将带有一段枝梗的颖花直插在培养基上，使花颖的基部和培养基接触。实验表明，带枝梗的颖花受精率高。3.2离体授粉的程序 离体授粉的一般程序是：确定

11、开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间；去雄后将花蕾套袋隔离；制备无菌子房或胚珠；制备无菌花粉；胚珠(或子房)的试管内授粉。 为了避免非实验要求的授粉，用作母本的花蕾必须在开花之前去雄并套袋。开花之后12d将花蕾取下，带回实验室进行无菌培养。首先将花萼和花瓣去掉，在70酒精中漂洗数秒后，再用适当的杀菌剂进行表面消毒，最后用无菌水冲洗34次，去掉柱头和花柱，剥去子房壁，使胚珠暴露出来。接种时，可将长着胚珠的整个胎座进行培养，或把胎座切成数块，每块带有若干个胚珠，之后再进行离体授粉。在离体柱头授粉时，需对雌蕊进行仔细的表面消毒，但不能使消毒液触及柱头，以免影响花粉在柱头上的萌发和生长。单

12、子叶植物的每一朵花为一个子房(胚珠)，玉米可用授粉前子房(由于子房有若干层苞叶保护，不必进行表面消毒)，可将果穗切成小块，每块带有2行共410个子房，获得的大量无菌胚珠可用来进行离体授粉。 为了在无菌条件下采集花粉，需要把尚未开裂的花药从花蕾中取出，置于无菌培养皿中直到花药开裂。若从已开放的花中摘取花药，应将花药进行表面消毒，然后将其置于无菌培养皿中直到开裂。将散出的花粉在无菌条件下授于培养的胚珠、胎座、子房、柱头上或其周围。如果胚珠表面有水分，则常抑制胚珠上花粉管的生长，因此胚珠接种后，在培养基表面如果出现水层，则应用无菌滤纸吸干，然后再进行授粉。据报道，把花粉授在胚珠或胎座上的效果，比撒在

13、胚珠周围的培养基上效果好。 离体授粉成功的标志是授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的种子。一般来讲，授粉后胚珠(或子房)可以在适宜其生长的培养基上培养，培养条件也无特殊要求。光照强度一般为1 0001x，光照时间1012hd。受精后的胚，有的可发育成种子，如烟草、矮牵牛、康乃馨等；有的是胚原位萌发，即授粉5周后，子房上可直接长出植株。4胚珠和子房培养4.1胚珠培养4.1.1胚珠培养的概念和意义胚珠培养是将胚珠从母株上分离出来，在人工控制的条件下，进行离体培养，使其生长发育形成幼苗的技术。根据培养目的的不同，可将胚珠培养分为受精胚珠培养和未受精胚珠培养。胚珠培养的意义为：通过受精前胚珠培养以及未受

14、精的胎座或子房培养，可以作为试管受精的基础；利用胚珠培养技术，使杂种尽早培养，防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；未受精的胚珠培养能和花药培养一样，诱导出大孢子或卵细胞增殖，形成单倍体植株，用于单倍体育种。4.1.2胚珠培养方法（1）材料的选择和灭菌培养受精胚珠，可根据培养的要求，由大田或温室取回授粉时间合适的子房；培养未受精胚珠，则应在授粉前适当时间摘取子房。用70的酒精表面消毒30s，5的次氯酸钠溶液灭菌10min，无菌水冲洗45次，无菌条件下剥离。用解剖刀沿纵轴切开子房，取出一个个胚珠，或者将带有胎座部分的胚珠一起取下接种。（2）培养基 培养基多为White、Nitsch、MS等，Nits

15、ch使用更普遍。培养授粉后不久的胚珠，要求附加椰子汁、酵母提取物、水解酪蛋白等，同时还可添加一些氨基酸，如亮氨酸、组氨酸、精氨酸等。离体胚珠发育中，培养基的渗透压起着重要的作用，特别是对幼嫩的胚珠。如矮牵牛授粉后7d，胚珠处于球形胚期，将其剥离置于蔗糖浓度为410的培养基上，即可发育为成熟的种子；若胚珠内含有合子和少数胚乳核，适宜的蔗糖浓度为56，而刚受精后的胚珠应为8。不同发育时期的胚珠对培养基的要求也不同。如罂粟授粉后24d的胚珠，培养时所要求的培养基较复杂，在Nitsch培养基上即使附加酵母提取物、水解酪蛋白、细胞分裂素、生长素等，也不能促进胚珠的发育。而采用发育到球形胚期的胚珠，用简单

16、的培养基就能成功。（3）胎座和子房对胚珠培养的影响胚珠授粉后的天数以及是否带有胎座，对培养的胚珠发育有显著的影响。如粟授粉后第6天的胚珠，从胎座上切下，置添加维生素的Nitseh培养基上培养，它所经历的发育过程与正常的胚珠大体相同，培养第20天的胚珠比自然条件下生长的胚珠大，并可形成成熟的种子，继续培养就会发芽形成幼苗。对带有胎座或子房的胚珠进行培养时，所需培养基较简单，而且受精后的胚珠也容易发育成种子。由此可以推测，胎座或子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要的作用。所以，在进行单个胚珠培养不能成功时，可考虑连胎座或子房一起进行培养。（4）胚发育时期的影响胚发育时期对胚珠培养成功与否有很大影响

17、。一般来说，合子和早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基成分也要求严格。培养发育到球形胚期的胚珠，较容易获得种子，对培养基的要求也不高。许多植物在含无机盐、蔗糖和维生素的培养基上即能获得成功，附加水解酪蛋白和椰子汁等，可促进其生长发育。4.2子房培养4.2.1子房培养的概念和意义子房培养是指将子房从母体上分离下来，置于培养基上，使其进一步发育成幼苗的技术。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠组成。在进行胚珠培养时，常因为分离胚珠困难而改用子房培养，其培养的意义在于：使未受精胚囊中的单倍性细胞诱导发育成单倍体植株；获得杂种植株；为试管受精提供一项基础技术。根据培养的子房是否授粉，可将

18、子房培养分为授粉子房培养和未授粉子房培养。4.2.2子房培养的方法（1）子房外植体的制备子房培养的方法与胚珠培养相似。若培养未受精的子房，一般选用开花前15d大田种植植株的子房；若培养受精后的子房，则应根据培养目的，选择不同授粉后天数的子房作为试材。子房培养与相同胚龄胚培养比较，难度大大降低。 单子叶植物的幼龄子房包裹在颖壳里，而颖花又严密包裹在叶鞘里，子房无菌，因此只要在幼穗表面用70的酒精擦拭，即可在无菌条件下剥取子房直接接种；双子叶植物的花蕾可以用饱和漂白粉溶液灭菌15min，无菌水冲洗后备用。对其他子房裸露的植物则应按照常规表面消毒程序，严格进行消毒。之后在无菌条件下，除去花萼、花冠或

19、颖壳，将子房接种于合适的培养基上进行培养。（2）培养基用于子房培养的培养基有MS、White、B5、N6、Nitseh等。此外，培养基的成分对子房的生长发育及成熟有很大的影响。如在一种含有无机盐和蔗糖的简单培养基上，培养屈曲花授粉后1d的离体子房，子房生长良好，但形成的胚比自然条件下的小。但在培养基中添加B族维生素后，可获得正常大小的果实。若在无机盐、蔗糖、维生素的培养基中再附加IAA，在离体条件下形成的果实比自然条件下形成的果实更大。（3）培养子房的发育由于在子房中存在两种细胞，即性细胞和体细胞，它们都可产生胚状体或愈伤组织，进一步发育成植株。因此，这些植株可以来源于性细胞，也可能来源于体细

20、胞。来源于性细胞的植株是单倍体植株；而来源于体细胞，即由珠被和子房壁表皮二倍体组织产生的植株，则属二倍体。正是由于胚状体或愈伤组织有两种不同倍性的起源，其后代会出现不同倍性的植株，若想通过子房培养从大孢子产生单倍体植株，必须设法控制不同倍性组织中的细胞分裂，为大孢子的细胞分裂创造良好条件。若培养子房中卵细胞已受精的合子，则可通过胚状体或愈伤组织再分化途径，产生二倍体植株，以获得杂种植株。（4）影响子房培养的因素由于子房培养的目的不同，要求子房的发育途径也不一样，可以通过控制培养基及激素条件调节子房发育的方向。受精后的子房通过离体培养，可形成果实，并得到成熟的种子。这种培养方式所要求的培养基也较

21、简单，常用的培养基有N6、MS、BN等。然而，要想诱导子房中的性细胞和体细胞形成胚状体或愈伤组织，并分化成植株，则对培养基的成分有一定的要求。如诱导未受精子房胚囊核单倍体组织发生，就需要在培养基中加人一定量的外源激素。水稻不加外源激素，子房不膨大，也不产生愈伤组织；当加入微量的生长素，可明显促进子房的膨大，并产生愈伤组织。大麦子房培养中，加入2，4D 0.5mgL+NAAl.0mgL+KTl.OmgL，可诱导其产生胚状体，并进一步形成单倍体植株。有些禾本科植物，在有IAA的培养基上，可诱导胚产生根，在含有IAA和腺嘌呤的培养基上可产生幼苗。此外，离体培养的研究表明，花被的功能不是仅仅充做性器官

22、的保护结构，在果实和胚胎的发育中它也起着重要的作用。如在培养普通小麦和斯卑尔脱小麦授粉后不久的子房时，只有小花的花被(内外稃)完整无缺，胚才能正常发育。若把花被去掉，原胚的生长就要受到损害。在大麦中La Croix等(1962)也发现了类似的结果，并由此断定“花被因子”是胚的正常发育所必需的。在双子叶植物中，去掉花萼也会导致果实发育不良。因此，当在离体条件下进行柱头授粉的时候，保留花冠是十分重要的。5离体授粉中影响结实的因子5.1外植体柱头和花柱的影响柱头是某些植物受精前的障碍，要克服这种障碍，必须去掉柱头和花柱。但叶树茂(1978)在烟草实验中发现，保留柱头和花柱，试管受精良好，平均有80的

23、子房能结种子。去掉部分柱头，对产生种子影响不大。但全部去掉柱头和花柱，子房结实率则较低。胎座的影响在试管受精中，子房或胚珠上带有胎座，有利于离体受精的成功。至今试管受精成功的大部分例子，都是用带胎座的子房或胚珠材料。同时多胚珠子房的离体受精也易成功。在玉米中，连在穗轴组织上的子房比单个子房离体授粉效果好。减少每个外植体上的子房数目虽然并不影响受精，但对籽粒的发育会产生有害的影响。外植体的生理状态由雌蕊上剥离胚珠的时间对于离体授粉后的结实率有明显影响。如开花后12d剥离的胚珠比开花当天剥离的胚珠结实率高。玉米果穗进行离体授粉的适宜时期是抽丝后34d。在剥离胚珠或雌蕊时，雌蕊的生理状态对离体授粉后

24、的结实率也有影响。如烟草授粉后剥离的未受精胚珠比未授粉雌蕊上剥离的胚珠离体授粉的结实率高。这是因为花粉在柱头上萌发或花粉管穿越花柱会影响子房内代谢活动，刺激子房中蛋白质的合成。因此，在离体授粉中，可以把剥离胚珠的时间选择在雌蕊授粉后和花粉管进入子房之前，从而增加离体授粉成功的机会。在进行柱头授粉的时候，应当避免弄湿胚珠和柱头的表面，否则将会影响花粉萌发，导致花粉管破裂，造成结实不良。5.2培养基离体授粉方法涉及到两个主要过程：花粉粒的萌发和花粉管的生长，结果导致受精；受精的胚珠发育为成熟的种子，里面有一个有生活力的胚。这项技术的效率在很大程度上取决于能够促成这两个过程的培养基的成分。要想实现花

25、粉萌发和花粉管生长并不困难。在胎座授粉中，当花粉粒撒落在胚珠上以后，若能在胚珠表面萌发，花粉管随即长入胚珠，与培养基并无接触。若花粉粒不能在胚珠表面萌发，就需要在一种适当的培养基上单独培养花粉粒，然后把花粉管置于胚珠表面。培养基最重要的作用在于促进受精胚珠的正常发育。因此，在进行离体授粉试验之前，先要对准备用做母本的植物的幼龄胚珠(含有合子或几个细胞的原胚)在培养中所需的最适营养成分和激素组成有所了解。常用于离体授粉的培养基为Nitsch、White、MS等。研究发现Ca2具有刺激花粉萌发和花粉管生长的作用（如十字花科植物的三细胞成熟花粉不易在离体条件下萌发，因而对这种植物难于进行离体授粉，如

26、先将离体胚珠在1氯化钙溶液中蘸一下，然后立即用花粉进行授粉，再把授粉的胚珠转到Nitsch培养基上。通过这种方法，获得了具有萌发力的种子。如不用氯化钙处理，则不能形成种子）。培养基中蔗糖的浓度一般为45，而玉米适合的蔗糖浓度为7。关于各种生长调节物质和其他补加物对胚珠培养中种子发育的效果，资料十分贫乏。常用的有机附加物是水解酪蛋白、椰子汁、酵母提取液等。烟草胎座授粉后加入这些附加物和少量的细胞分裂素、生长素，能显著提高子房的结实数。5.3培养条件在离体授粉中，培养物一般都是在黑暗或光照较弱的条件下培养的。Zenkteler(1969，1980)发现，无论培养物是在光照下培养还是在黑暗中培养，离

27、体授粉的结果没有任何差别。Balatkova等(1977)指出，在某些实验中温度可以影响结实率。离体授粉培养的温度一般为2025，但水仙属(Narcissus)植物中，15比25更能显著增加子房的结实数。而罂粟由于是在较温暖的条件下开花的植物，低温培养并不能提高结实率。5.4基因型离体子房培养与结实之间的效应取决于植物的种类。如十字花科的植物花粉粒在培养条件下萌发困难，需改进试管受精技术，以期获得可萌芽的种子；有证据表明，离体授粉的玉米子房对培养的反应存在着基因型差异。6离体授粉的应用当在离体情况下进行胚珠或胎座授粉时，必须把柱头、花柱和子房壁组织几乎完全去掉，以排除花粉管进入胚珠的障碍，因而

28、当自交不亲合区域是处在柱头、花柱或子房中时，这项技术在自交或杂交实验中将会是非常有用的。现在已经证明，胎座授粉方法至少可用于以下几个不同的领域：6.1克服自交不亲合性如腋花矮牵牛是一个自交不亲合物种，在自花授粉的雌蕊中，花粉萌发的情况虽然很好，但在子房区域存在障碍，花粉管不能进入胚珠受精。在这类植物中，当以自身花粉进行胎座授粉以后，受精和结实都能正常进行。6.2克服杂交不亲合性离体胎座授粉方法最重要的应用潜力，是在那些由于受精前不亲合性障碍从未形成过杂种的植物间建立杂种。通过远缘杂交可以得到一个杂种合子或幼龄原胚，其中结合了两个各具不同优良特性的亲本染色体组。然后，再对杂种胚进行精心培养，使之成熟，或诱导杂种原胚愈伤组织分化器官，这在育种上是很有价值的。6.3通过孤雌生殖产生单倍体能通过未受精子房培养产生孤雌生殖单倍体的植物已知有大麦、烟草和小麦等。6.4培育抗逆性植物如高温下离体授粉，可以培育耐热的玉米植株。Petoline等（1990）观察到，高温（38）下只有耐热的花粉能有效受精，产生表达耐热形状的玉米植株。这一研究表明，离体授粉对培育抗环境胁迫植物也有应用潜力。7单个雌雄配子的体外受精 20世纪90年代，植物生物技术领域中一项里程碑式的进展