VDACWesternBlotting操作步骤

1、VDACWesternBlotting操作步骤 一、配制试剂： 1） 30%Acr（丙烯酰胺）-Bis（甲叉双丙烯酰胺） Acr29.2g Bis0.8g 37C,溶于 60ml 去离子水中，定容至 100ml,确定 pH7,4c 棕色瓶保存（保质期30 天）o 注意：戴手套操作 2） 10%（W/V）SDS SDS（电泳级）10g 双蒸水 90ml 68c 溶解，浓 HCl 调 pH 至 7.2,定容至 100ml,室温保存。 3） 1.5MTris,pH8.8 Trisbasej 羟甲基氨基甲烷）18.15g 双蒸水 80ml 溶解后，浓 HCl 调 pH 至 8.8,定容至 100ml,

2、灭菌、4c 保存。 4） 0.5MTris,pH6.8 Trisbasej 羟甲基氨基甲烷）6g 双蒸水 60ml 溶解后，浓 HCl 调 pH 至 6.8,定容至 100ml,灭菌、4c 保存 5） 10%AP（过硫酸钱） AP0.100g 双蒸水 1ml 溶解后，50 履分装后，-20C 保存。 6） 0.5%（W/V）澳酚蓝 澳酚蓝 0.0050g 双蒸水 1ml 溶解后，室温保存。7） 3XSDS 凝胶加样缓冲液 9）洗脱液 甲醇 225ml 双蒸水 225ml 冰乙酸 50ml 混匀，室温保存。 8） ）考马斯亮蓝染色液 洗脱液 100ml 考马斯亮蓝 R2500.25g 充分溶解，

3、whatman1 号滤纸过滤染色液，室温保存。 9） ）转膜缓冲液 Trisbase（E 羟甲基氨基甲烷）5.82g 甘氨酸 2.93g 甲醇 200ml 双蒸水稀释定容至 1000ml,室温保存。去离子水 0.5MTris,pH6.8 甘油（丙三醇） 10%SDS 0.5%（W/V）澳酚蓝 B-琉基乙醇 充分混匀后，0.5ml 分装,1.55ml 2.5ml 5ml 0.4g 0.4ml 100 仙 l -20C 保存。 样品：加样缓冲液=2:1 8）5X 电泳缓冲液 总体积 Trisbase（E 羟甲基氨基甲烷） 甘氨酸 1000ml SDS 去离子水稀释定容至 1000ml,4c 保存。

4、 使用时，取 100ml5X 电泳缓冲液，加入 15.15g72g 5.0g 400ml 去离子水，充分混匀，即可。 使用时，密闭预冷至 4C。 12)10XPBS KCl KH2PO4 NaCl Na2HPO4-7H2O 加双蒸水稀释定容至 2g 2g 80g 21.6g(/Na2HPO4-12H2O 1000ml,4c 保存备用。 29.0g) 13）封闭液 脱脂奶粉 BSA PBST 现配现用。 1.0g 0.2g 20ml 14)PBST 总体积 1000ml Tween20 1XPBS 定容至 0.5ml 1000ml,室温保存。 二、实验步骤 1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品

5、蛋白质 1）装板： 先用无水酒精将玻璃板擦干净，晾干，选玻璃较为平整的一面向下，保证底边平整否则会漏胶。 2）配制分离胶 (12%) 总体积 10ml 5ml 在干净的小烧杯内依次加入 蒸储水 3.4ml 1.7ml 30%Arc-Bis 4.0ml 2.0ml 1.5MTris(pH8.8) 2.5ml 1.25ml 10%SDS 0.1ml 0.05ml 10%AP 50-80pl 25-40al TEMED 5-8 口 2.5-7 履 一旦加入 TEMED 应立即快速旋动混合。提醒：先将需要的三把枪准备好,分别吸取TEMED,APffi 配好的分离胶。 3）灌分离胶： 迅速在两玻璃板的间

6、隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注积层胶所需的空 间（电泳梳下缘 1cm 处），再加蒸储水使其平整，并可以封闭氧气和胶的反应。将凝胶垂直放置于室温下，约 30min 后见一折线，倒出水，用滤纸吸取残余水分。 4）配制积层胶（即浓缩胶，5%）: 总体积4ml 在干净的小烧杯内依次加入：蒸储水 2.28ml 30%Arc-Bis0.68ml 0.5MTris（pH6.8）1.0ml 10%SDS0.04ml 10%AP20pl（40） TEMED4 口（8） 一旦加入 TEMED 应立即快速旋动混合。 5）灌积层胶: 混匀后立即加入玻璃板间隙中，并灌至满，把干净的电泳梳（水洗干净， 临用前用无水乙醇擦

7、洗，挥发至干）轻轻插入胶液中，室温放置 30min（也可4c 冰箱过夜），待胶聚集后，小心移出电泳梳，备用。 6）收集蛋白： 取肝组织 1g（约全肝重），放入匀浆管内，加入 1.5mlPBS,机器匀浆，充分混匀后，转入 1.5ml 离心管中 10000 转/分，离心 10min,吸取上清液 0.5ml,加入1.5XSDSS 胶力口样缓冲液 1.0ml,混匀。（以上操作均在 4c 进彳 T）4c 保存。 7）蛋白样品的处理： 将样品置于沸水浴中加热 5-8min,样品高度粘稠，样品分装后，4C 保存。 8）上样： 按预定顺序加样，每个样品加 10 仙 l,预染 Marker 上样量为 10 仙

8、l 左右，尽量把样品加到孔底部，两端孔及所有不用的样品孔中加上等体积的 1 XSDSS 胶加样缓冲液。（含蛋白量 40-50ug） 9）电泳： 将电泳装置与电源相接，灌注电泳缓冲液，稳压 80V,约 1 小时，待澳酚蓝到达分离胶的低部停止电泳。取下胶块，标记出泳道的左右和 Marker 的位置，以免转膜后无法识别。 11）如果仅做 SDS-PAGE 那么此时可将胶块进行考马斯亮蓝染色：（事先将预染的 Marker 切下） A.用至少 5 倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的摇床上于室温染色 1 小时以上。 B.移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液 中，平缓摇动 4 小时

9、，其间应更换脱色液三四次，至背景较白，可见电泳条带。含 20%的甘油的水中，可拍照保存。 C.脱色越充分，考马斯亮蓝染色法的蛋白质检出下限就越低，脱色 24 小时通常能检测到单一条带中含量低至 0.1 仙 g 的蛋白质。 11）如果将继续进行 WesternBlot 转膜分析，那么此时的胶块不用染色，而是用于转膜。 D.转膜分析（戴上手套） 11） 切膜： 将分离出的胶切去上端积层胶,余约 4.5x8.8cm 的长方形,量出胶的长、宽，切大小与之相同的 1 张 PVDFM,将胶、滤纸、纤维垫置于转膜缓冲 液（可用两次）浸泡一下，PVDF1 先用甲醇浸泡再放入转膜缓冲液。 12） 转膜： 将固定

10、盒打开， 黑色一面向下， 从下到上依次放入： 纤维垫、 滤纸、 胶、 PVDFF1（做标记）、滤纸、纤维垫，注意：用玻璃试管滚动挤出 PVDF11 和胶上的气泡。把固定盒夹紧，放入槽内，再置入冰盒（事先制冰），倒入转膜缓冲液，约500ml,在电泳槽内放入转子，使转膜时温度保持4C,盖上盖子，设定电压为100V（350mA,时间为 1 小时。如果冰盒的冰已经化掉了，可以用冰袋代替。 13） 转膜后，膜用 PBS洗 3 次，每次 5min。 14） 包被封闭非特异性蛋白： 取出膜，放于封闭液中，37C、振荡 1 小时（或室温、振荡 2 小时）。PBST 漂洗 1 次，每次 5min,备用。 15）

11、 抗体反应： i. 一抗包被：在饭盒内，将膜浸入 1:4000 稀释的 VDAC 多抗 （Sigma 公司）稀释液中（新鲜的 PBST 配制），或 1:8000 稀释的 B-actin 一抗（1：10 稀释的）之中 4c 孵育过夜。用银子将膜转移到干净的培养皿中，用适量 PBSTR 洗 12 次。每次 5 分钟。提醒：抗原较少时，选择 4c 过夜较好；一抗稀释液可回收 4c 保存重复使用 2-3 次；因抗体的浓度过高会导致反应过强，使得膜的背景过高，但若抗体浓度过低会导致难以检测到特异的蛋白质，用系列稀释的抗体检测小膜条，很容易确定抗体的工作浓度，正确的工作浓度可以得到低背景和高特异性的条带。 手工将膜切成各泳道大小的条带，浸入在倍比稀释的抗体溶液中反应，倍比稀释和十倍稀释方法较为常用。 ii. 二抗包被：在培养皿内，将膜浸入 1:8000 稀释的羊抗兔 （pierce 公司）VDAC 勺二抗之中，或