甲烷单加氧酶的研究进展

1、甲烷单加氧酶催化机理的研究进展摘 要：甲烷单加氧酶是甲烷营养细菌代谢过程中的重要酶系，同时也是一类能够很好地催化底物分子单加氧反应的生物催化剂，在工业应用、医药和环境治理方面有着广泛的应用前景。文章综述了近年来在甲烷单加氧酶催化机理方面的研究，着重阐述了含非血红素双铁核的结构及活化氧分子和底物的机理。关键词：甲烷单加氧酶；活性中心；催化机理加氧酶：催化分于氧的氧原子与底物结合的氧化反应酶的总称，属于氧化还原酶类。梅森等（HSMason et al，1955）用18O2示踪，根据18O结合于其氧化生成物而发现的，可分成氧分子的双原子氧与底物结合的加二氧酶（dioxygenase）和仅结合一原子氧

2、，且必需有对另一原子氧的氢供体（NADPH等）的单加氧酶（monooxygenase）。后者亦称混合功能加氧酶（mixedfunction oxygenase）或羟化酶。甲烷单加氧酶：甲烷单加氧酶（methane monooxygenase，MMO）是一类含有双核铁活性中心的非血红素蛋白酶1，是甲烷营养细菌（methanotrophic bacteria）代谢过程中产生的重要酶系，也是自然界中为数不多的能够同时活化分子氧和小分子烃的酶系之一2-4。MMO 能断裂非常稳定的C-H 键，将分子氧中的一个氧原子插入C-H 中，另一个氧原子则生成水。反应过程见下式： CH4 + NADH + H O2

3、 CH3OH + NAD H2O MMO 催化烷烃发生单加氧反应生成相应的醇的过程与其他单加氧酶如细胞色素P450很类似，但在所有的单加氧酶中，只有MMO 能催化非常稳定的甲烷有效氧化生成甲醇，而这个反应在催化化学上是难以实现的。甲醇作为一种清洁的汽油替代品，是C1 化学重要的原料。目前，天然气作为甲烷的主要来源，一般是通过水蒸气重整法制成合成气，然后再进一步深度开发。此法存在投资大、设备复杂、能耗高、选择性差的缺点，且产品不宜直接用来合成甲醇和其他烃类5。如果能够使用酶直接催化甲烷生成甲醇，就具有速度快、选择性高、条件温和等优点，对于深度开发天然气资源，解决世界能源危机有着深远的影响。除了催

4、化甲烷进行单加氧反应外，MMO 还有着非常广泛的底物谱，包括：C8 以下的饱和的、不饱和的、线状的、分枝的、芳香族的、环状的和卤化的烃类。反应生成的产物有：醇类、环氧化物、苯酚等6。其中MMO 催化烯烃进行环氧化反应生成环氧化物是化学合成制药工业的重要中间体，催化卤代烃类和芳烃类的氧化在环境污染的控制中具有潜在的应用价值。目前研究表明，MMO 还能降解污水中的致癌物质N-亚硝基二甲胺7。MMO 的这些特性使其受到了极大地关注，对其催化机理的研究也成了国际上引人注目的前沿领域。1.MMO简介：在甲烷营养细菌中，存在可溶性甲烷单加氧酶（soluble MMO，sMMO）和颗粒性甲烷单加氧酶（par

5、ticulate MMO，pMMO）。基本上所有的甲烷营养菌中都含有pMMO，一般存在于细胞膜上，但是由于pMMO 难以纯化和不稳定性，目前对其了解还不多。目前研究得比较深入的是来源于Methylococcus capsulatus（Bath）和Methylosinus trichosprium OB3b 两个菌株的sMMO。sMMO 是一种三组分的复合酶体系。三组分蛋白分别是羟基化酶MMOH，还原酶MMOR 和蛋白调节酶MMOB。双核铁活性中心一般以三种形式存在，氧化态：FeIIIFeIII，混合态：FeIIIFeII 和还原态：FeIIFeII 2。氧化态和还原态的MMOH 的结构如图1

6、所示。由图1 可以看出，氧化态的MMOH的两个FeIII 是通过1 个羟基、1 个双齿的谷氨酸和1 个水分子的外源桥构成的三重桥彼此联接。还原态的MMOH 中两个FeIII 少一个羟基桥。MMOH 中的铁离子是以-氧桥连接的双铁金属簇的形式存在。还原态和混合态的MMOH 能与底物、分子氧结合，并使之活化，如还原态的MMOH 单独存在时能够催化丙烯的环氧化反应8。在催化过程中，MMOH 被不断地氧化，当其完全转化为氧化态后就不再有催化活性，只有得到MMOR 辅助，才能使之还原恢复活性。2 MMO的作用机理 ：对 MMO 结构的了解，给深入研究MMO 的催化机制提供了良好的开端。MMO 的催化反应

7、过程中，三个亚基的作用是不同的， MMOH是 MMO的催化活性单元；MMOR 接受 NADH 的电子，并将电子传递到 MMOH；MMOB 在 MMOH和 MMOR 之间的电子传递中起到调节作用； 而 NADH 在催化过程中作为 MMO的电子给体，每转化一分子底物需要消耗一分子 NADH9。2.1 MMOH 的催化机理：如图2 所示，MMOH中含有的氧化态双核铁活性中心在催化反应过程中首先接受NADH的两个电子成为还原态，然后还原态MMOH 与氧分子反应，经过两个中间体O、P（过氧桥连MMOH），最终形成FeIV 双核铁簇Q。中间体Q 与底物分子结合，经过中间体R、T，释放出产物并重新回到MMO

8、H 的氧化态。目前对MMOH 催化反应机理的研究主要集中在两个方面：(1)分子氧的活化；(2)烷烃的活化。2.1.1 分子氧的活化机理 分子氧活化是指在反应过程中， 中间体 P转化到中间体 Q的过程中 O-O键的断裂方式。关于其断裂方式的争论目前主要集中在均裂反应（homolytic cleavage）和异裂反应（heteroliytic cleavage）两种。 （1）分子氧的异裂机制 Lee等18在对来源于M. trichosprium OB3b中sMMO的动力学研究基础上提出了分子氧异裂的理论。通过对 pH效应和质子总量的研究表明，在催化反应过程中需要两个质子。氧分子先与双铁核中心形成一

9、个过氧桥，形成中间体 P，此时加入一个质子，使其中一个氧原子质子化形成单齿的过氧化态中间体 TS1。另一个质子作用于中间体 TS1 向 Q转换过程中，使 O-O 键发生异裂，形成高价态双核铁簇。此时，一个氧原子作为双核铁中心的氧桥，另一个氧原子形成了水，过程如式所示：（2）分子氧的均裂机制 均裂机制大部分的理论，主要是利用理论化学的方法对中间体 P 和中间体 Q 模型化合物及其相互间转化的研究。但在不同的计算方法中 P有着不同的结构，均裂机制的过程见式：与异裂机制不同的是，在分子氧均裂机制中，由分子氧衍生的O-O 键都保留下来作为中间体Q 的氧桥，形成水分子的氧原子是由双铁中心原来保留的桥连氧

10、原子形成的。 烷烃 C-H的活化机理MMO催化氧化反应的分子机制研究的第二个重点是烷烃 C-H键的活化， 目前有两种主要的机制：自由基回弹机制（radical rebound mechanism）和协调的氧插入机制（concert insertion of an oxygen atom） 。 （1）自由基回弹机制 自由基回弹机制最早由Lipsomb等人提出，Rabion等10也通过理论计算验证了此机制。据推测，中间体Q的进一步活化形成不对称的FeIIIFeIV-氧基自由基。这种自由基从烷烃中夺取一个氢形成FeIIIFeIV-羟基自由基，生成的甲基自由基迅速与四价铁中心重组，形成弱的Fe-C键。

11、Basch，Lippard，Yazunari等最近用理论研究说明了夺取氢原子的反应机理，从而验证自由基回弹机制。过程见式：（2）协调的氧插入机制协调的氧插入机制（又称协调的无自由基机制，concert non-radical mechanism）是由Newcomb等11运用甲基立方烷烃作为自由基探针来研究M.capsilalus Bath菌的sMMO后提出的Yoshizawa 等19认为甲烷首先和 FeIV配位形成一种五价碳中心，随后通过两步协调的氢和甲基转变形成甲醇。过程见式：2.2 MMOB 的作用机理MMOB 的作用是影响 MMOH和 MMOR 之间的电子传递过程。不同的光学研究方法表明

12、，MMOB 通过靠近 MMOH 的双核铁中心，将活性中心结构进行轻微的改变从而影响MMOH催化反应的速率、区域选择性及其氧化还原的能力12。然而 MMOB 作为一个微小的辅因子如何进行调节 MMO的催化的过程尚不清楚。2.3 MMOR 的催化机理及电子传递过程MMOR 含有一个Fe2-S2簇和一个 FAD 辅因子，它们的作用是传递电子13。上式说明了这个电子传递过程。 NADH 首先和 MMOR 中的 FAD发生作用，FAD 接受 NADH 的电子，形成了电荷转移（charge-transfer）中间体 CT1，位于 NADH 的烟酰胺分子和 FAD的异咯嗪环中间。当氢离子由 NADH 转移到

13、 FAD 时，就形成了第二个电荷转移中间体 CT2。它比 CT1 要活泼，释放 NAD+同时将电子从 FADH转移到Fe2-S2ox，再由 FAD还原Fe2-S2中心。这个单电子转移的步骤产生了黄素半醌和Fe2-S2red 。最后由还原态的Fe2-S2将电子传递给 MMOH 的双核铁中心。其电子传递链为：3结论与展望：总之，近年来在 MMO的研究方面取得了很大的进展，通过动力学、理论化学和光谱动力学等方法，MMO 的催化机理正被逐步深入了解。MMO 催化反应高效、条件温和、无污染，催化烷烃的羟基化、烯烃的环氧化和卤代烃、芳烃的降解反应使得 MMO在工业应用、医药和环境治理上有着广泛的应用前景。

14、只有更加清晰的了解 MMO的催化机制，才能尽快地使 MMO得到应用， 造福人类。 然而目前存在影响 MMO进行工业应用的问题主要有： （1）MMO 需要辅酶如 NADH 作为反应过程中氢或电子的传递体，而辅酶价格昂贵且不稳定，将成为工业应用中的瓶颈因素。 （2）菌种的来源不同，酶的催化机理可能不同目前还没有统一的机理来解释 MMO的反应过程。因此，对 MMO的催化机理的研究有待深入。同时，MMO催化过程中辅酶的循环问题还有待解决。 目前，对 MMO 进行结构模拟的模型化合物层出不穷14。模型化合物具有结构简单，稳定性强，机理研究容易， 反应过程中不需要辅酶等优点，为进一步了解 MMO和进行MM

15、O工业应用指出了一条新的道路。未来所面临的挑战就是解决 MMO的工业应用问题，以及利用 MMO的结构和催化机制合成一些功能型的模型化合物替代 MMO，从而展开工业应用。参考文献： 1 RYLE M J, HAUSINGER R P. Non-heme iron oxygenases J. Curr Opin Chem Biol, 2002, 6(2):193-201. 2 MERKX M, KOPP D A, SAZINSKY M H, et al. Dioxygen activation and methane hydroxylation by solublemethane monooxyg

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