生物制药毕业论文

1、柏树内生真菌的分离与抑菌研究学院：生命科学学院专业:制药工程-生物制药目 录摘要iAbstractii1.前言11.1 植物内生真菌11.1.1内生菌概念1 植物内生真菌11.2 植物内生真菌研究现状及应用2抗肿瘤活性物质2抗菌活性物质2产酶的内生菌3抗虫抑菌类物质3植物生长调节物质3产香气的内生真菌4生物防治4其他作用41.3 白蚁及白蚁的危害4白蚁4白蚁的危害51.4 白蚁的防治7物理防治法7化学防治法7生物防治法81.5 本试验研究的目的及意义82.材料与方法102.1 材料及设备102.1.1 分离内生菌所用树木及指示菌102.2.2培养基102.2.3 主要仪器设备102.2 试验方

2、法11 内生真菌的分离11 内生真菌的纯化11 摇瓶培养12 牛津杯法抑菌实验123.结果与分析143.1 柏树木内生真菌的分离143.2 活性筛选结果144.讨论185.结论19参考文献20附录22致谢23摘 要植物内生真菌作为生活在植物组织内部的一大类微生物，在其生活史的一定阶段或全过程中对宿主不表现出明显病症。在长期共同进化过程中，植物内生菌与宿主植物之间形成了一种共生关系。香柏和罗森绘具有天然的抗白蚁特性，按照基因可互相传递的原则推测，香柏的内生菌可以产生对白蚁有抑制作用的活性物质。因此本实验旨在从具有天然抗白蚁树木的树枝、树皮中分离出能抗白蚁的内生真菌。利用白蚁体内共生菌作指示菌，采

3、用牛津杯法做抑菌试验，得到抑菌功能效果好的菌株HDF-I-217 和HDF-I-232。下一步将对该两株菌进行鉴定，提取其代谢产物用于防治白蚁，这将具有极大的开发利用价值。关键词内生真菌；白蚁；分离AbstractAs a big group of microbe inhabiting in the tissues of living plants, the endophytic fungi have nosignifieantly negative effects on the host plants during their whole life history or some phase

4、s. During the long process of the common evolution, a symbiosis system formed between endophytes and host.Port-orford-cedar and eastern red cedar have the natural character of anti-termite. According to the principle of the genes mutually transmitting between the plant and the endophytes, it is supp

5、osed that the endophyte from Port-orford-cedar can produce active compound which has inhibition for termite.So the research separates the endophytic fungifrom the branch and the pill of the natural anti-termite trees.We obtained the dominance endophytes named HDF-I-217 and HDF-I-232 by the cylinder

6、plate method in the microbiostatic experiment, they can inhibit the microbes which live in the termite gut. The next step we will identify the two fungi and extract metabolites for preventing and controlling termite, which will have a greatdevelopment of value.Key wordsendophytic fungi; termite; iso

7、lation1.前言1.1植物内生真菌 内生菌概念对内生菌的定义认识是不断发展的。首先由De Bary提出，内生菌是指生活在植物组织内的微生物，以区分那些生活在植物表面的表生菌(Epiphyte)；后来Carroll将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，这个内生菌概念不包含植物致病菌和菌根菌1。目前，内生菌概念是由Stone等提出的，是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物(至少暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物

8、组织内直接扩增出微生物DNA的方法来注明其内生2。也就是说我们可以把植物内生菌理解为生活于植物组织内的正常菌群，不仅包括互惠共利的内共生微生物，也包括潜伏在宿主植物体内的病原菌3。植物内生真菌植物内生菌主要有细菌、真菌和放线菌。内生真菌(Endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。近年来的研究表明，内生真菌可以产生与宿主相同或相似的代谢产物。植物与内生真菌呈互利共生的关系：一方面，植物为内生真菌提供光合产物和矿物质；另一方面，内生真菌产生的代谢物，或能刺激植物的生长发育，或能提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能

9、力。这些代谢物中的一部分，正是应用前景广阔的新型生物活性物质，有很高的开发利用价值4。1.2植物内生真菌研究现状及应用内生真菌广泛存在于健康植物组织内部，是植物微生态系统的重要组成部分。内生真菌产生的各种活性物质，在生物制药、农业生产、工业发酵等方面都表现出美好的应用前景，受到世界各国专家的广泛关注。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足人们日益增长的需求；同时有利于珍稀、濒危药用植物资源的保护，对减少野生药用植物多样性的破坏具有重要意义。药用植物具有丰富的物种多样性，是人类生存与发展的重要自然资源。各种药用植物中蕴藏着非常丰富的内生真菌。通过与药用植物

10、的“协同进化”，某些内生真菌具有了产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力。抗肿瘤活性物质植物中极低的含量和植物资源的有限是人类规模利用这些化合物所面临的主要困难。这造就了从红豆杉等植物中去寻找能产生紫杉醇的内生真菌。从红豆杉的内生真菌中不仅分离出了紫杉醇，现已从红豆杉及其近缘植物分离到了许多种产紫杉烷类化合物的内生菌。落羽松(Taxodium distchum)、榧树(Torreya grandifolia)、银杏(Ginkgo biloba)、秃柏(Toxodium distichum)以及一种松树(Wollemia nobilis)中都分离到了能产生紫杉醇的内生菌，这为紫杉醇的来源问

11、题提供了很好的解决办法5。以中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)株作为模型，对喜树内生真菌次生代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验，结果表明从喜树的树皮和树枝中均分离了能产生抑制CHO细胞增殖活性的内生真菌6。郭智勇等7从三种红树林内生真菌Paecilomyces sp.(treel-7)，4557，ZZF65中分到九个环肽类的次级代谢产物，其中得到的环Pro-Leu具有强的抗癌活性及特殊的抗菌活性而被称为灭癌素。抗菌活性物质多种药用植物本身具有抗菌消炎作用，因此其内生真菌也是筛选抗病原菌菌株的理想途径，已有多种药用植物内生真菌被研究过抑菌活性。从黄花夹竹桃分离到的内生真菌中有17株具有抑菌活性，其中一株

12、木霉(Trichoderm sp.)抑菌活性最强，抗菌谱最广1。Wagenaar等8从薄荷的一株内生真菌Phomopsis longicolla的培养物中，分离提取出一种新的抗生素dicerandrols，它具有很强的杀菌作用。目前人们已知的抗生素远不能满足需求，植物内生真菌是一个未开发的新领域，它们所产生的抗生素活性成分往往是新颖的。因此，开发植物内真生菌为寻找新的抗生素提供了具有广阔的前景。产酶的内生菌近年来，关于内生菌产酶的报道越来越多，利用内生菌产生的酶体系经过筛选可用于有机合成、新药开发等领域，是丰富天然产物的又一新途径。内生真菌产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能

13、产生果胶酶、纤维素酶、醋酶等胞外酶。有些酶具有较高的商业应用价值。2001年Stamford等人发现从薯蓣属蚕豆中分离出来的内生放射形拟诺卡菌可以产生耐热性-淀粉酶；次年，又发现玉米叶中的内生真菌链孢子囊菌在pH8.0的淀粉-Czapek培养基上可以高效产生耐热葡萄糖淀粉酶9。抗虫抑菌类物质内生真菌可增强宿主对病虫害的抵抗能力，这是因为有的内生真菌在宿主内和纯培养中产生有毒物质，如有机胺类，麦角生物碱等。这些内生真菌的代谢产物可对植物致病菌和有害昆虫产生抗性。国内外关于内生真菌在农药领域的研究与开发尚处于起步阶段，报道极少，因此值得深入研究与开发。从药用植物海金沙中筛选抗小麦赤霉菌、番茄早疫霉

14、菌、番茄灰霉菌等植物病原真菌的内生真菌，并进行活性物质检测。结果表明80以上的内生真菌对3种农作物病原真菌具有较强的抗菌活性10。植物生长调节物质内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的生长发育具有很重要的作用。内生真菌能产生促进植物生长的物质如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。内生真菌也能通过增强植物吸收N、P等营养元素，或与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而间接促进植物生长。研究发现，金线莲等4种兰科药用植物的内生真菌能够产生赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)等植物生长调节剂12。产香气的内生

15、真菌从香料植物香茅草上分离到一株产香内生菌XCY-1，液体发酵后分析鉴定其发酵液的挥发性成分，共鉴定出74个化合物，其中有乙缩醛二乙醇、柠檬烯、月桂烯、月桂醛等多种香料物质。产香内生菌给新的香料资源开发提供了理论依据13。生物防治植物内生真菌的专一性很强，除了对其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外，对其他生物没有直接影响，而且内生真菌还可通过人工接种被导入不同的植物并可通过宿主的种子进行遗传；内生真菌分布于植物组织内，有足够的碳源、氮源，而且受到植物组织的良好保护，具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用，因而具有作为生物农药的优良特性。兰琪等14从苦皮藤(Celastrus angula

16、tus)植株中分离到39株内生真菌，其中3株内生真菌发酵产物的丙酮提取物对番茄灰霉病等6种病菌的菌丝生长有较强的抑制作用。在盆栽试验中，内生真菌发酵产物的丙酮提取物对供试病菌的治疗和保护作用均在50以上，有的内生真菌在一定条件下可成为拮抗菌。由此可见，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌。但内生真菌提高植物抗病性的机制，以及内生真菌如何影响寄主防御相关的酶系活性还不清楚。其他作用药用植物内生真菌具有一些其他有益的生理作用，如除草活性、抗结核、抗疟、免疫抑制作用、抗氧化，降解纤维素、保鲜等12。1.3白蚁及白蚁的危害白蚁白蚁属于昆虫纲(Insects)等翅目(Isoptera)，

17、是地球上最古老的社会性昆虫，距今大约有2.5亿年的历史。全世界有大约2600种白蚁，我国有500余种。白蚁在分类上的地位和名称经历了100多年的不稳定。从解剖学和社会组织性特征可以把白蚁分为两大类群，即低等白蚁，包括澳白蚁科(Mastotermitidae)、木白蚁(Kalotermitidae)、草白蚁科(Hodotezmitzdae)、原白蚁科(Termopsidae)、鼻白蚁科(Rhinotermitidae)、齿白蚁科(Serritermitidae)和高等白蚁即白蚁科(Termitidae)共七个科。高等白蚁较低等白蚁有更细致的内外部解剖学特征和更强的社会组织性。低等白蚁吃木质性食物

18、(吃草的草白蚁除外)，肠内有原生动物和细菌共生；白蚁科占白蚁总数的75，吃树、草、凋落物和含矿物质的土壤，有丰富的肠细菌共生，但原生动物很少见15。白蚁作为社会性昆虫的类群之一，低等白蚁与肠道微生物共生是其特征，很多研究者经常选择其作为研究材料。白蚁肠道呈螺旋状，其中存在着原生动物，发酵性螺旋体，同型产乙酸细菌，甲烷细菌和硫酸盐还原菌，它们对白蚁消化木质纤维素类食物有着重要作用16。白蚁的危害作为森林“分解者”，白蚁对森林的物质循环起了很大作用；反之，作为木材害虫，它给人类带来了各种危害。白蚁是喜温性昆虫，只要具备了适宜的温度，湿度和食物等条件，就能很快的繁殖，扩散。白蚁的繁殖危害可造成严重的

19、损失，全世界每年直接和间接的损失达数十亿美元。由于白蚁危害的严重性和广泛性而引起了人们的重视。在欧洲，散白蚁(Reticulitermes)造成的财产损失最大，仅法国每年损失就达2亿欧元。在意大利、西班牙、葡萄牙和希腊，白蚁对建筑的侵害也很严重，很多具历史意义的建筑被严重损坏。随着欧洲经济复苏，在5年内，年除害处理费用至少达到10亿欧元。.1白蚁对建筑物的破坏白蚁对建筑物的破坏，特别是对砖木结构、木结构建筑的破坏，由于其隐蔽在木结构内部破坏或破坏其承重部位，往往造成房屋突然倒塌，导致财产损失和人员伤亡，引起人们的极大关注。近年来，随着钢筋混凝土建筑的增多，被白蚁破坏造成倒塌的危险性的比率是在逐

20、步降低。但是，新的大厦内部木结构仍可遭受白蚁破坏。白蚁不仅危害木结构，而且它分泌的蚁酸也可以腐蚀金属。因此，新建房屋必须进行白蚁预防处理。.2白蚁对堤坝的破环在我国南方诸省、区的堤坝白蚁危害极为普遍，堤坝白蚁主要危害种类是土白蚁属和大白蚁属，在中国有广泛的分布。尤其是长江流域及其以南的江河堤围和山塘水库，普遍遭受白蚁的危害，常常出现蚁患险情和灾难。这些白蚁在堤坝内2-3m甚至更深处，修筑直径达lm以上的巢，密集营巢，蚁道四通八达，有些蚁道甚至穿通堤坝的内外坡。当汛期水位升高时，常常出现管涌、滑坡、垮坝险情。.3白蚁对农作物的危害白蚁可以危害花生、木薯、桑、茶、玉米、小麦、水稻等农作物，尤其对甘

21、蔗的危害十分严重。另外，白蚁对杨梅、山核桃、杉木、樟树、按树、刺槐、垂柳、悬铃木、白杨、重阳木、拐枣等林木、果树等的危害也具有相当的广泛性和严重性。在南方丘陵地区，杉木林基地的蚁害率一般达4060。在广州市郊区，公路两旁的按树蚁害率达90以上。.4白蚁对通讯设备的破坏埋地塑料电缆和通讯设备也常遭白蚁蛀食。在南方，白蚁造成的通讯电缆故障占总故障率60，广东省则高达80。电力电缆被白蚁咬穿护层后，还易引起短路，导致电力转送中断，甚至酿成火灾。据报道，我国南方已有12个省、市、自治区，发现白蚁破坏埋地塑料电缆情况。.5白蚁对其他物品的危害白蚁还能危害图书、文物、织物、武器、账册、钱币、地下电缆等，造

22、成重大损失。.6白蚁对生态环境的危害据统计世界上的白蚁群每年向大气排放2000万吨蚁酸，蚁酸产生化学物质，污染大气，此项污染已超过了汽车和工业烟雾对环境造成的污染。目前各国肿瘤专家认为：空气越污染，癌症的发病率就越高。由此看来白蚁是个不可忽视的祸根17。1.4白蚁的防治物理防治法使用简单工具、机械及利用光、热、电等来防治白蚁的方法，它具有杀蚁直接、不造成环境污染、不破坏木材等被处理物的特点，特别适用于文物、木竹制品等白蚁的防治。主要有：人工挖取白蚁巢，利用射线，热能，电能防治白蚁以及灯光诱杀等。物理屏障技术，主要是利用砂子、玄武岩石子颗粒、金属网、金属板和PVC板等物质作为物理或机械屏障，防止

23、白蚁进入建筑物内造成危害的方法。是利用白蚁只能通过1 mm以上的空隙，但不能用口器搬运直径大于1 mm的石头颗粒的特点，设计障碍物阻止白蚁通过。这种方法的优点主要是能预防白蚁进入建筑物内进行为害，而不是驱赶或灭杀接近建筑物的白蚁；可结合建筑物施工时完成，花费不高，对环境友好。不足的是未能阻止分飞的蚁群进入建筑物。在澳大利亚、加拿大和美国的夏威夷，这种技术投入商业运用已超过10年，申请了多个专利。物理屏障法可根据需要采用以下几种屏障材料：筛网，石头颗粒，防护板，防水膜和钢结构等18。物理防治虽然具有无污染、无残留、无毒害等优点，且有的措施还能在短时间内使白蚁死亡，但是，由于使白蚁死亡的有效物质（

24、光、电、热、射线等）均要直接作用到白蚁，才能使白蚁死亡，致死物在蚁群中不能增值传染，不能依靠白蚁间相互感染消灭整个蚁群。因而，物理防治较适宜于局部处理，不能广泛应用于白蚁防治，难以达到长久有效的要求。化学防治法化学防治因其毒杀效果好，驱避强烈，所以仍然是目前最主要、最普遍研究的白蚁防治方法。在防治过程中一般是利用化学防治剂的触杀、胃毒、熏蒸等作用来歼灭白蚁。目前常用的白蚁防治方法主要有：粉剂毒杀法，泼浇法，毒饵诱杀法，熏蒸法等. 药剂的毒力是化学防治的核心，在防治过程中，药剂无增值作用。而高效低毒对化学防治来讲，是一项难以克服的矛盾。现在的化学防治研究，也只能提高药剂的利用率，降低防治工作的损

25、耗量，无法避免使用毒剂，只能使实际用药量尽可能接近防治所需的最小用药量。目前我国及各国市场上常用的白蚁防治剂主要有：砷制剂、金属盐类、无机酸类、有机氯(氟)类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、硅烷类、有机杂环类和昆虫生长调节剂等。砷制剂是无机白蚁防治剂的重要品种，主要品种如亚砷酸(As2O3)、砷酸铅、亚砷酸钠等。亚砷酸俗称砒霜，是一种强胃毒剂。利用白蚁的互相吮舐习性，还可制成各种诱杀剂使用。该药是我国目前使用量最大的灭蚁剂，但在潮湿环境下灭蚁效果不佳。目前，随着人们环保意识的加强，逐渐被淘汰。有机氯(氟)药剂其主要品种如氯丹(chlordane)等。氯丹的触杀、胃毒、熏蒸作用强烈，且残

26、效期长，广泛用于新建房屋的白蚁预防，是我国过去使用量最大的白蚁预防药剂。但是，由于这些药物的强残留作用和高汽化性，我国现在已经停止生产并禁止使用。硫酰氟(sulfurylfluoride)和溴甲烷是目前我国被允许使用的2种熏蒸剂，但溴甲烷在发达国家已于2005年被禁止使用，发展中国家则需在2015年完全淘汰。有机磷类代表为毒死蜱(chlorpyrifos)，是一种有机磷类高效白蚁防治剂。触杀、胃毒和熏蒸作用强烈，而且长效、广谱、低残留。毒死蜱是国内目前最有可能替代氯丹的较理想药剂，也是目前国外使用最多的白蚁预防药剂。此外，拟除虫菊酯类药剂是目前世界上品种最多的白蚁预防药剂，以氯菊酯(perme

27、thrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)等菊酯类为有效成分为代表的白蚁防治剂，已在美国甚至全世界都占有较大的市场比例19。生物防治法随着科学技术的进步和人们对白蚁习性的了解，生物防治白蚁将是未来白蚁防治的主流。利用生物源物质作为白蚁防治剂对白蚁进行控制和减灭的技术称为生物源物质防治技术。这一技术由于可选种类多样、作用方式独特和环境和谐性良好等优点而受到产业界和大众的重视。植物是未来杀白蚁剂的宝库，它的提取物对白蚁具有毒杀、驱避和拒食作用。已有越来越多的杀虫植物活性物质用于白蚁防治。伊可儿等20从83种树木提取液中，筛选出29种树木提取液对白蚁均有较

28、强的忌避活性效果。利用可引起白蚁致病致死的病原微生物(真菌、细菌、病毒等)在蚁群中感染、传播，而达到防治白蚁的目的。目前微生物防治虽然还处于试验研究阶段，但是国内外科技工作者通过不懈努力，已取得可喜的成果。黄曲霉Aspergillus flavus、白僵菌Beauveria bassiana、绿僵菌Metarhiziumanisopliae等对白蚁的毒力也较高21。目前，利用这类真菌防治白蚁申请了多个专利。混合使用昆虫病原线虫的Xenorhabdus、Photorhabdus共生细菌和病原真菌球孢白僵菌或金龟子绿僵菌可防治白蚁，并申请了专利22，23。微生物(真菌、细菌、病毒等)具有选择性强的

29、特点，只要选择只对寄主(白蚁等昆虫)有作用，对人、畜和农作物等无害、无污染的微生物，就能达到低毒的要求。另一方面，微生物在使寄主致病致死的过程中，本身也在急剧繁殖，具有增殖作用。而且，白蚁是营巢居的集群生活，相互间有交哺，舔舐的习性，特别是“对病蚁舔唰至死为止”的特性，为微生物在蚁群中感染传播提供有利条件，使微生物防治有可能达到高效的要求。1.5 本试验研究的目的及意义香柏具有天然的抗白蚁、抗腐蚀等特性，且已从这种树中分离到香榧醇、香柏酮等十多种具有抗白蚁作用物质。按照基因可互相传递的原则推测，这些抗白蚁物质可能由其内生菌产生，而使香柏具有抗白蚁的功能。本试验从柏树中分离内生真菌，以在白蚁体内

30、分离的产纤维素酶、木质素酶的共生菌作指示菌，利用牛津杯法对分离到的内生真菌的代谢产物做抑菌试验，筛选出抑菌效果好的菌株。以筛选到的菌株代谢产物来杀灭白蚁，为白蚁的微生物防治开辟出新的途径，不仅达到了防治白蚁的目的，也解决传统方法对环境的毒害问题。2.材料与方法2.1 材料及设备2.1.1分离内生菌所用树木及指示菌柏树(Port-orford-cedar)树枝、树皮；指示菌：细菌HDB-II-003、HDB-II-005，真菌HDF-I-006、HDF-I-008（白蚁肠道内分解纤维素的内生菌，由本实验室从黑翅土白蚁肠道内分离并保存） 培养基（1）分离培养基：树木浸汁20mL，琼脂20g，蒸馏水

31、980mL，pH 自然；（2）真菌分离培养基：酵母膏1g，树木浸汁20mL，琼脂20g，链霉素终浓度30.0µg/mL,蒸馏水980mL，pH4.8；（3）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，固体培养基加入2的琼脂；（4）半固体牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入0.6琼脂，加热溶解，分装小瓶，每瓶25mL；（5）查氏培养基：蔗糖30g，NaN032.0g，KCl O.5g，MgS04O.5g，FeS04 O.O1g，K2HP041.0g，蒸馏水1000ml，pH自然，固体培养基加入2的琼脂；（6）

32、半固体查氏培养基：查氏液体培养基中加入0.6的琼脂，加热溶解，分装小瓶，每瓶25mL；（7）水琼脂培养基：琼脂20g，蒸馏水1000m1，pH自然；以上培养基在1.05kg/cm2，121，20min高压蒸汽灭菌后备用。 主要仪器设备电子天平：梅特勒托利多仪器上海有限公司全自动灭菌锅（SANYO Electric Co.Ltd.）；柜式恒温冷冻摇床HQL300A：中国科学院武汉科学仪器厂超净台SWCJ2FD：苏净集团安泰公司电热恒温培养箱Q/BKYY28-200：上海跃进医疗器械厂生化培养箱LRH250A：广东省医疗器械厂保鲜柜LC156：海尔集团低速离心机LD52A：北京医用离心机厂光学显微

33、镜SA3000：北京泰克仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG9140A：上海一恒科技有限公司2.2 试验方法 内生真菌的分离用灭菌解剖刀分别取主干和侧枝的树皮、韧皮部和木质部，切成薄层小块(两端均需有切口)，约1cm×1.5cm大小，用自来水将表面清洗干净晾干，无菌操作置于75乙醇消毒35min，后用无菌水冲洗34次，0.1升汞消毒30s，再用75乙醇消毒1min，无菌水冲洗34次，将横截面切段接入已倒好的分离培养基上，将培养皿置于28培养箱中倒置培养35d。大约 35d后在分离培养基上长出菌，然后三区划线法把菌接入真菌分离培养基，分离出单菌落。 内生真菌的纯化接种物培养23d后，其

34、边缘长出菌丝，用接种针挑取切口处新长出的菌丝，及时转接至查氏培养基上培养，待菌落出现后，按以下方法逐步纯化，对菌株编号后，转至查氏斜面培养基上，于28培养箱中培养34d，然后放入4冰箱保存。2.2.2.1平板划线分离法先用灭菌的接种环挑取少许菌，在琼脂平板上划Z线至平板三分之一处，此为一区，一区要密些，然后灼烧接种环，将接种环冷却后，划二区，划线要与一区交叉一次，同理划三区与二区交叉一次。三区要划的分散些，以便容易分离出单菌落。2.2.2.2稀释涂布平板法（1）倒平板 将查氏固体培养基加热溶化，待冷至5560时，倒平板。（2）制备菌悬液将待测菌接入装有10mL无菌水的试管中，振摇约20min，

35、用一支1mL无菌吸管吸取1mL菌液，加入到盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀。然后用另一无菌移液枪从此试管吸取1mL混合液加入另一瓶盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀。以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同浓度的菌悬液。（3）涂布将上述培养基的平板底面分别标记上10-5、10-6、10-7、10-8四种稀释梯度，然后用无菌移液枪分别由10-5、10-6、10-7、10-8四管中吸取0.1mL菌液对号放入相应的平板中，用无菌玻璃涂布棒轻轻涂匀，静置510min。（4）培养将平板倒置于28培养箱中，培养2448h。（5）挑菌落将培养后长出单个

36、菌落的平板分别调取少许菌体接种到查氏斜面上，28培养箱中培养34d，4冰箱保藏。 摇瓶培养无菌操作条件下，将分离出的内生真菌用接种环接种于盛有200mL查氏液体培养基的500mL三角瓶内，每菌株1瓶，在28，140r/min的摇床上振荡培养711d。 牛津杯法抑菌实验.1培养基（1）水琼脂培养基：作为双层培养基的底层（23mm），使之与上层的半固体培养基结合紧密，在去掉牛津杯加入发酵液后，发酵液不会外泄；（2）查氏半固体培养基：用于培养真菌；（3）牛肉膏蛋白胨半固体培养基：用于培养细菌。.2立牛津杯制备水琼脂平板：灭菌后的水琼脂培养基分别装于已灭菌的培养皿内（约15mL），冷凝后在培养基上均匀

37、放置2个已灭菌的牛津杯。.3菌悬液的制备预先把指示菌在室温下活化2h，然后在超净台上用接种环刮取两环菌种置于30mL无菌水中，摇匀，制成菌悬液。.4双层培养基的制备在无菌条件下，用移液枪吸取1mL菌悬液加入到盛有25mL半固体培养基的小三角瓶中，其中细菌指示菌加入到牛肉膏蛋白胨半固体培养基，真菌指示菌加入到查氏半固体培养基，混匀后，倒入已立有牛津杯的水琼脂培养皿中备用。.5发酵液的制备将摇瓶培养的真菌发酵液，在无菌条件下，倒入已灭菌的离心管中，3500rpm离心12min。弃去沉淀，取上清液置于已灭菌的三角瓶内。.6 抑菌实验待上层半固体培养基冷凝后，用镊子沾取酒精经火焰灭菌后，将双层培养基中

38、的牛津杯轻轻拔出（要保持边缘圆滑）。用移液枪将150L已制备好的发酵液注入到牛津杯留下的孔内。室温放置34h后放入生化培养箱内，细菌指示菌28培养16h左右，真菌指示菌28培养48h左右，测其抑菌效果。3.结果与分析3.1 柏树木内生真菌的分离把处理过的木块置入含有树木浸汁的水琼脂培养基，同时另取同样处理过的小木块在对照培养基平板上滚动擦拭，此平板与分离平板一起培养，以检验树木小块表面消毒是否彻底。小木块置入水琼脂培养基，可最大程度减少染菌的机会。通过观察，发现对照培养基上没有生长任何微生物，证明分离到的微生物为植物的内生菌。本试验从柏树木中分离获得了34株内生真菌，编号为HDF-I-211至

39、HDF-I-244。3.2活性筛选结果从34株内生真菌中选取第711d发酵液进行处理，分别对细菌指示菌HDB-II-003、HDB-II-005，真菌指示菌HDF-I-006、HDF-I-008作抑菌试验，测试其抑菌活性。试验结果见表4-1、表4-2。结果表明有4株菌株分别为HDF-I-217、HDF-I-224 、HDF-I-232、HDF-I-241的代谢产物对细菌指示菌有较好程度的抑菌活性，有5株菌株HDF-I-217、HDF-I-219、HDF-I-232、HDF-I-237、HDF-I-242的代谢产物对真菌指示菌有较好程度的抑菌活性。综合以上结果编号HDF-I-217、HDF-I-

40、232抑菌效果最好。菌株HDF-I-232抑菌效果见附录。表4-1 内生真菌活性筛选抑菌结果Table 4-1 The screening results of bacteriostasis for endogenous fungi指示菌菌种第7 d第8 d第9 d第10 d第11 d细菌-003细菌-005细菌-003细菌-005细菌-003细菌-005细菌-003细菌-005细菌-003细菌-005HDF-I-211HDF-I-212HDF-I-213HDF-I-214HDF-I-215HDF-I-216HDF-I-217+HDF-I-218HDF-I-219HDF-I-220HDF-I-

41、221HDF-I-222HDF-I-223HDF-I-224+HDF-I-225HDF-I-226HDF-I-227HDF-I-228HDF-I-229HDF-I-230HDF-I-231HDF-I-232+HDF-I-233HDF-I-234HDF-I-235HDF-I-236HDF-I-237HDF-I-238HDF-I-239HDF-I-240HDF-I-241+HDF-I-242HDF-I-243HDF-I-244注：0<(平均抑菌圈直径)<6mm；+：6mm <<10mm；+：10mm<<16mm；+：16mm<<26mm；+：26mm

42、表4-2 内生真菌活性筛选抑菌结果Table 4-2 The screening results of bacteriostasis for endogenous fungi 指 示菌菌 种第7 d第8 d第9 d第10 d第11 d真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008真菌-006真菌-008HDF-I-211HDF-I-212HDF-I-213HDF-I-214HDF-I-215HDF-I-216HDF-I-217+HDF-I-218HDF-I-219+HDF-I-220HDF-I-221HDF-I-222HDF-I-223HDF-

43、I-224HDF-I-225HDF-I-226HDF-I-227HDF-I-228HDF-I-229HDF-I-230HDF-I-231HDF-I-232+HDF-I-233HDF-I-234HDF-I-235HDF-I-236HDF-I-237+HDF-I-238HDF-I-239HDF-I-240HDF-I-241+HDF-I-242+HDF-I-243HDF-I-244注：0<(平均抑菌圈直径)<6mm；+：6<<10mm；+：10mm<<16mm；+：16mm<<26mm；+：26mm4.讨 论近年来，内生菌由于其独特的生理特性及在自然界

44、中重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注。植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。从对植物内生菌的存在、分布、种类、到内生菌的生理特性，各类研究竞相开展并颇有成效。而内生真菌作为微生物中的重要类群，若能对其进行合理的开发与利用，从中寻找并发现新型先导化合物，则将成为开发新药物、研制新农药的重要途径。在分离过程中，HDF-I-219的分离出现了一些困难，在视野中的菌形态并不均一，经过多次的梯度稀释、划线分离后，得到了纯的单菌落。因此，在菌的分离过程中，要严格坚持无菌操作，操作时要有细心耐心。本试验在分离内生真菌过程中，为检查材料表面消毒的效果，做如下对照试验：将上述同样表面消

45、毒过的小块直接置于分离培养基平板上作对照培养处理，结果若对照材料周围均无任何真菌长出，证明表面消毒彻底，从而保证了所分离出的真菌是植物的内生真菌而不是空气中的或组织块表面附生的微生物。有些内生真菌专一性地寄生在植物体内，不能在人工培养基上生长，即使使用不同的营养培养基培养，也不能确保把生活在植物组织内的所有真菌全部分离出来。有些已分离到的内生真菌在人工培养基上不产生可育性孢子，就会由于菌丝体的死亡而造成菌种丢失，因此不能准确地反映出植物组织内生菌的数量和种群。提高内生菌所产生的抗菌化合物的产量，将来可以采取常规诱变、基因工程等手段选育高产菌株以及优化培养基成分、研究发酵条件和代谢调控等方法提高

46、抗白蚁化合物的产量。植物内生真菌的研究存在许多问题，只有通过对内生真菌全面系统的研究，并借助于其它学科的研究方法和手段，进一步完善其基础理论，才能推动植物内生真菌研究的不断深入，丰富微生物资源。植物内生真菌这一资源将得到更多更合理的开发与利用，为医学和农业的发展做出巨大贡献。5.结 论5.1从柏树中分离得到34株内生真菌；5.2菌株HDF-I-217、HDF-I-224、HDF-I-232、HDF-I-241的代谢产物对白蚁肠道内生细菌具有抑菌活性；5.3菌株HDF-I-217、HDF-I-219、HDF-I-232、HDF-I-237、HDF-I-242的代谢产物对白蚁肠道内生真菌具有抑菌活性；5.4综合以上筛选结果菌株HDF-I-217、HDF-I-232抑菌效果最好。参考文献1 张晓瑞.植物内生菌及其开发应用研究进展J.现代生物医学进展.2007，7(11):1747-1750.2Stone J K, Bacon C W, White J F. An o