第二十章 胆固醇逆向转运研究方法

1、 第二十章 胆固醇逆向转运研究方法第一节胆固醇及胆固醇酯测定一、高效液相色谱分析细胞内胆固醇及胆固醇酯(一)胆固醇标准品配制称1.5g标准胆固醇溶于少许乙醇中，逐渐升温到2o°C，并把乙醇体积补满到150ml,标准胆固醇的工作浓度分别为0.129(50)、0.258(100)、0.516(200)、1.032(400)、2.064 (800)。单位mmol/L(mg/L)。4下储存备用。(二)细胞内胆固醇及胆固醇酯的提取将每10ml细胞收集人带盖的10ml塑料管中，1500r/min、4离心15min、去上清，用1ml 0.9%Nacl溶液重新稀释细胞，冰浴中超声破碎细胞。工作条件为

2、600W,工作时间为4s，间隙时间为8s，定时次数为6次。用Lowrry法测定蛋白含量。在细胞溶解产物中加人等体积新鲜配制的15%醇溶性KOH(一20)，振荡至细胞溶解产物清亮，加人6%的三氯乙酸去蛋白，再加人等体积的正己烷：异丙醇溶液(4:1,V：V)，将混合物涡旋5min，然后1500r/min、15离心5min，收集上层有机相。(三)高效液相色谱(high performa·ce liquid chromatogram,HPLC)分析采用Waters991型色谱系统，其中包括510泵、U-6K进样器、991型光电二极管矩阵监测器、TCM色谱恒温盒，采用Waters公司生产的Ge

3、n-PAK FAX柱，以异丙醇：正庚烷：乙腈(35:12:53,V：V：V)为流动相，进行非梯度洗脱，流速1ml/min，柱温保持4(加冰块)，紫外检测时间12min，检测波长为226nm.Gen-Pak FAX柱子在使用前用去离子水洗10min(流速0.5ml/min)以除去柱中的醇类物质。(四)细胞内游离胆固醇及胆固醇酯定量1、游离胆固醇的定量胆固醇以峰面积定量，蛋白质用BCA法定量。参照PierceChemical公司的BCA试剂盒说明书的方法进行。按A ：B=50 ：1的比例配置显色工作液。以牛血清蛋白(BSA)为标准，并以标准蛋白的吸光值作标准曲线。取11支洁净的试管，分别标好111

4、,1号为空白管，26号为标准蛋白管，711号为待测蛋白管。空白管中加入1ml AB显色工作液，1ml蒸馏水，26号管分别按顺序加人浓度为31.25、62.5、125、250、500µg/ml的标准蛋白0.1ml，分别加入AB显色工作液0.9ml，蒸馏水1ml，7、8、9、10、11号管为待测样品，各测定管分别加入待测蛋白0.1ml,AB显色工作液0.9ml，蒸馏水1ml，混匀，37水浴30min，室温放置，以蒸馏水为空白管调零，在波长562nm下，测各管的OD值。2、胆固醇酯的定量 以胆固醇酯酶(cholesterol esterase,CEase)水解，以HPLC测定总胆固醇(to

5、tal cholesterol,TC)，以总胆固醇减去游离胆固醇(free cholesterol,FC)代表胆固醇酯(cholesteryl ester,CE)的量，以mg/g细胞蛋白为单位。3、胆固醇峰鉴定(1)保留时间：通过比较标准胆固醇出峰时间与样品中各峰的出峰时间，与胆固醇标准的保留时间接近的峰即可能是胆固醇峰。(2)外标法：首先进一针样品，记录其色谱图，接着用相同样品量与相当量胆固醇标准混合进针一次，记录其色谱图，样品中加标准胆固醇液色谱图中明显升高的峰就可能是胆固醇峰。(3)内标法：待细胞处理结束后，弃培养基，PBS洗3次，加人细胞裂解液500µl，反复冻融3次裂解细胞

6、，BCA法定量蛋白后，7.2%三氯乙酸沉淀蛋白，800g离心10min，取上清进行胆固醇检测，以豆甾醇为内标。取100µl上清液加入8.9mol/L，醇溶性氢氧化钾溶液400µl，水解30min后使胆固醇酯为胆固醇。各待测样品分别与内标混匀，用正己烷和无水乙醇抽提后，1.5mol/L三氧化铬氧化衍生30min后，真空干燥，200µl乙腈：异丙醇(80 ：20)溶解样品，进样进行高效液相色谱分析，采用C18柱，柱温4，流速1ml/min，检测波长250nm，胆固醇以峰面积定量，内标校准，计算值以蛋白含量校正（µg/g蛋白)。(4)光谱分析法：把样品中各峰的

7、光谱图形与标准胆固醇的光谱图形进行比较，与标准胆固醇光谱图形相同的就是样品中胆固醇峰。(5) L-B(Liberman-Burchard)反应法：收集样品中各峰，并浓缩，然后用L-B法直接显色。具体操作如下：取10ml试管一支，往其中加人0.2ml样品、0.5ml冰醋酸和5.0ml乙酸酐，于振荡器上剧烈振荡混匀，5min后1500g离心5min，吸取上清液4.0ml于25水浴5min，最后加0.2ml浓硫酸显色，在630nm处比色，测定光密度值。注意以上几种方法常联合起来进行分析。(五)高效液相色谱测定细胞内胆固醇及胆固醇酯的特点1、测定泡沫细胞内胆固醇和胆固醇酯的重要性 泡沫细胞(foam

8、cell) 的形成是动脉粥样硬化形成的始动步骤，研究泡沫化过程是探索动脉粥样硬化防治的一条重要途径。泡沫细胞的形成是由于细胞内胆固醇酯的积累而引起的，而泡沫细胞的细胞学定义为细胞内胆固醇酯占总胆固醇的50%以上，因而，研究泡沫化过程的一个重要方面就是要求准确地测定胆固醇与总胆固醇的比值。通过测定U937细胞内胆固醇酯与总胆固醇，能找到一种判断泡沫细胞与非泡沫细胞而较为精确实用的方法。2、高效液相色谱测定的特点  高效液相色谱具有适于微量分析的特点，近年来国内外很多学者基本上不采用化学显色法测定胆固醇(胆固醇酯)，而采用高效液相色谱的方法，如董军等采用高效液相色谱法分析人胎肝细胞培养基

9、中7-酮基胆固醇。采用高效液相色谱测血清中胆固醇及胞内胆固醇(胆固醇酯)测定要求较高。最近，国外学者采用HPLC分析胞内胆固醇，但在细胞内有些胆固醇酯种类尚未搞清楚的情况下，没有标准品，因而，尚不能单独依靠HPLC法来对胆固醇酯进行精确定量。因此在对U937单核细胞株泡沫化前后胞内胆固醇(酯)分析时，采用适于用核酸分离的Gen-PAX分离柱，能较为直观地看出ox-LDL处理48h的U937细胞内胆固醇酯含量明显高于对照组细胞内的胆固醇酯的含量，并且其胆固醇酯与总胆固醇的比值大于50%，符合泡沫细胞的定义(这种处理的U937细胞以通过细胞形态鉴定，油红O染色可见胞浆有许多细小的红染脂质颗粒，电镜

10、下胞浆中可见大小不一的融合脂滴)，故可以认为处理组细胞为泡沫细胞。采用异硫氰酸苯酯衍生法和苯甲酰氯衍生法虽能对胆固醇较好定量，但对胆固醇酯也同样不好单独定量。采用高效液相色谱虽具有很多优点，但在操作时仍有很多值得注意的地方。其中之一是色谱柱的选择，一般来说，三种常规柱子(分子筛、反相、离子交换)中以反相柱分辨率最高，但由于胆固醇(酯)本身疏水性较强，如采用C18填料反相柱，即使采用非极性较强的洗脱剂(如正庚烷：异丙醇：乙腈)，胆固醇根本就无法从柱子上洗下来，如再采用非极性更高的洗脱剂，则黏度太大，压力太高，造成分辨率低。有些非极性试剂即使可以把胆固醇(酯)洗下来，但表现出是一种非特异性洗脱，故

11、在HPLC分析胆固醇(酯)时采用疏水性较弱的柱子，Waters公司生产的Gen-PAX柱，是在以硅胶作填料的基础上，在硅醇基上接上多聚碱基的阴离子材料，这种型号的柱子填料的碱基既具有部分疏水性，又具有部分阴离子交换的性质。另外，我们采用真空冷冻干燥的浓缩方法，进一步提高了该方法的灵敏度。通过图20-1中“A”图与“B”图的比较，可见处理组细胞与非处理组细胞之间不但胆固醇酯与总胆固醇之比存在差异，其胆固醇酯的种类及不同胆固醇酯含量的多少都有可能存在差别。即有些种类的胆固醇酯可能在非泡沫细胞中原来没有，而是在泡沫化过程中形成的；有些胆固醇酯种类也可能在泡沫化过程中丢失；有些则在泡沫化之前含量很少。

12、而在泡沫化过程中合成急剧增加；有些则在泡沫化前后无多大变化；有些则可能在泡沫化之前含量较多，而在泡沫化过程中含量较少。如能搞清楚以上所述这些胆固醇酯的变化，无疑有利于加深我们对泡沫化过程的了解。二、细胞内胆固醇测定其他方法(一)化学法直接皂化-硫酸铁铵比色法快速测定样品中的胆固醇：准确称取充分混匀的样品约0.20g于50ml具塞比色管中，加入2.0mol/L的K0H-乙醇溶液5.0ml，振荡混匀，置65°C水浴中皂化30min(每隔5min振摇1次)后取出，经流水冷却，加入饱和氯化钠溶液2.0ml后再加入石油醚20.0ml，旋涡混匀后离心分离，吸取上清液1.0ml于25ml具塞比色管

13、中，再于65°C水浴中通氮气吹干，加入4.0ml冰醋酸溶解残渣、加入2.0ml硫酸铁铵显色剂，混匀，10min后在分光光度计560nm波长处比色测定。按测得的吸光度在标准曲线上査得相应的胆固醇含量。         硫酸铁铵储备液：溶解4.463g硫酸铁铵于100ml 85%磷酸中。硫酸铁铵显色剂；10ml硫酸铁铵储备液用浓硫酸稀释至100ml，将此液放置在硅胶干燥器中备用。胆固醇标准液(1.0mg/m1)：准确称取胆固醇l00mg，溶于冰醋酸中，并稀释至100ml。胆固醇标准使用液(0.10mg/ml)取胆固醇标准储备液10.0ml

14、，用乙酸稀释至100ml.(二)生物法1、酶法(1)原理：以胆固醇酯酶(CEH)水解血清中的胆固醇酯(CE)，同时以胆固醇氧化酶(CHOD) 将胆固醇(chol)氧化成胆甾烯酮和过氧化氢(H2O2)的方法。终点产物的测定有4胆甾烯酮分光光度法及测H2O2的方法，其中应用最广的是用Trinder显色反应系统，试剂含过氧化酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)和酚，三者合称PAP,目前，国内胆固醇试剂盒都用这种方法。CEHCE十H2Ochol十脂肪酸 Chol十O24胆甾烯酮十H2O2PDOH2O2十4AAP十酚醌亚胺染料十4H2O红色醌亚胺的最大吸收波长为500nm，由于吸收峰平坦，波长4

15、70550nm均可用，为了减少胆红素与血红蛋白的干扰，可用520nm比色。(2)试剂及纯度CEH (EC3.1.1.13)：来源于假单胞菌属等微生物，杂酶中葡萄糖氧化酶与尿酸酶应小于0.01%，不含过氧化氢酶，比活约100U/mg酶蛋白(25°C，chol油酸酯为底物)。CHAD (EC1.1.3.6)：来源于诺卡菌等微生物，杂酶中葡萄糖氧化酶与尿酸酶应小于0.01%，不含过氧化氢酶，比活约45U/mg酶蛋白(37°C，chol为底物)。POD(EC1.1 1.1.9)：来源于辣根，纯度值(reinheitszahl比值，A403nm/A275nm）约为3.0，比活1000

16、U/mg酶蛋白(25，ABTS单位)。   表面活性剂Triton X-100:不含过氧化酶，不会使配好的酶试剂增加空白读数。磷酸盐、胆酸钠、4-AAP与酚均为分析试剂。试剂配制(终点法测定用)。磷酸盐缓冲液，pH7.7,0.3mol/L，CEH(假单胞菌)800U/L，CH0D(诺卡菌) 400U/L，POD(辣根1000U/L，胆酸钠3mmol/L，4AAP 0.5mmol/L，酚3. 5mmol/L. Triton X-100 3g/L.缓冲液用于复溶其他试剂，酶与显色剂可以分装为两管，其剂型可以为水溶液、冻干晶或干粉。磷酸盐缓冲液可用Tris缓冲液替代，后者的浓度为

17、l00mmol/L,pH7.7，为了提高灵敏度，酚可以用其衍生物或其他色原代替。(3)胆固醇参考标准物质(standard reference material,SRM) ：TC测定要求做到标准化，与国际标准取得一致，必须有准确可靠的SRM.   酶法测血清TC时，由于血清中大部分胆固醇是酯化的，而血清基质对这些酶促反应有明显的影响，故不宜采用纯胆固醇结晶配制的溶液作为TC酶法分析的标准液，而应以准确定值的血清作为SRM,国际上有美国国家标准与技术研究所(NIST)的SRM909人血清及美国疾病控制中心(CDC)提供的定值人血清，我国已有国家技术监督局批准的"人血

18、清胆固醇标准物质”(国家一级标准GBW09138，卫生部北京老年医学研究所研制）。     血清SRM的TC定值应按参考方法进行。操作者必须训练有素，能准确与熟练地掌握参考方法，测定误差应1%，参考方法中所用标准物为纯胆固醇结晶，如美国NIST的SRM911b，其纯度为(99.8%土0.1%)。我国相应一级标准GBW09203a的纯度也达到 (99. 8%土10. 1%).常规TC酶法测定中所用定值血清是商品TC试剂盒所带的次级标准(可称为定标物或校正物calibrator)时须用我国的血清cholSRM(国家一级标准GBW09138)为标准，用参考方法或文本规定

19、的酶法作准确测定的定标物使用。血清cho1SRM及定标物有冻干的与冰冻保存的液态血清两种，用前必须彻底混匀，血清保存太久可能出现浑浊，冻干血清复溶后也会有浑浊，一般不影响chol标定值。(4)操作步骤：终点测定法：标本(血清或血浆)10µl，标准液10µl，酶试剂1.0µl,设空白对照管。温度与时间：37 5min或2025 10min，检测波长520nm，颜色稳定至少60min，故在达终点后60min内比色。计算公式：         TC(mmo1/L)=A1/A0×定标血清TC浓度(mmol/L)注

20、：A1为测定样品的吸光度值，A0为胆固醇标准的吸光度值。2、荧光式光纤生物传感装置的测量原理  采用胆固醇氧化酶(C0D)作为传感装置的敏感基元，在胆固醇溶液中，COD对胆固醇的氧化起催化作用，胆固醇的氧化反应如下所示：胆固醇十O2十COD4-胆烯酮十H2O2其中，C0D指胆固醇氧化酶，反应中O2，的损耗量与溶液中胆固醇的含量成正比，因而通过测量耗氧量即可得出胆固醇的含量。荧光碎灭原理：根据物质分子吸收光谱能级跃迁机制，具有吸收光子能力的物质在特定波长光的照射下成为激发态分子，然后以辐射跃迁的形式降落到较低能级并在瞬间发射出比激发光波长更长的光，即荧光。另有一些物质与特定荧光物质发生

21、作用可以导致荧光强度下降，这就是荧光碎灭作用，产生这种作用的试剂称为荧光碎灭试剂。荧光的碎灭过程可用Stern-volmer方程定量描述：I。/I=。/=1+KQ 式中，I。、I、。、分别为无氧和有氧环境下的荧光强度和寿命，K为Stern-Volmer常数，Q 为碎灭剂浓度，可以通过测量碎灭荧光强度以达到测量碎灭剂浓度的目的。因采用相移法测量所选用的光源经过正弦调制，因而荧光试剂发出的荧光也呈正弦变化，并且相对于激发光有一滞后相移，它与荧光寿命存在如下关系：tan=式中，为正弦调制信号角速度，=2，为正弦调制信号的频率。结合上面两式，可以得出以下关系tan。/tan=1+ KQ 式中，。和分别

22、为无氧和有氧时的滞后相移。从上式可以看出，测量碎灭荧光强度已转化成测量胆固醇溶液进行催化反应后的氧碎灭滞后相移值，在测定出各氧气分压和溶解氧含量的滞后相位值，通过作图得到传感装置的特征曲线，然后由测出的任意气体氧分压、胆固醇溶液和血浆溶液的滞后相移值，通过换算求出所测气体氧的分压、胆固醇溶液的浓度和人体血浆中胆固醇的含量。第二节泡沫细胞模型及胆固醇流入/流出模型一、泡沫细胞模型(一)U937泡沫细胞模型1、氧化型低密度脂蛋(oxided low density lipoprotein，LDL）的制备    超速离心提取LDL。0.8%琼脂糖凝胶电泳，考马斯亮蓝染色显示为单一

23、条带。采用Lowry方法,以牛血清白蛋白作标准品，测得LDL浓度为2.5 g/L。将LDL置于含10µmol/L Cu2SO4的PBS中37透析12h后，在含0.1%EDTA的PBS中透析24 h,0.2µm微孔滤膜过滤除菌备用。用硫代巴比妥酸反应物质含量来鉴定LDL的修饰程度。以四乙氧基丙烷为标准品，用每毫克LDL蛋白中丙二醛的含量来表示。按说明书操作，测得新鲜LDL的丙二醛为2.1µmo1/g，经CuSO4处理的LDL即ox-LDL的丙二醛含量为25.3µmol/g。   2、U937细胞的培养及处理U937细胞株系人类单核细胞系

24、，倍增时间为2448h,在含10%胎牛血清的RPMI-1 640培养基中呈悬浮生长。U937细胞置于37。C含5%CU2和95%空气的培养箱中培养，细胞密度为10 9个/L左右，毎两天换液一次。将新换液的U937细胞分为对照组和处理组，对照组只加培养基，处理组另加ox-LDL至终末浓度为80mg/L，培养48h后收集细胞。   3、U937细胞油红O染色  收集细胞低速离心制成细胞悬液，涂于干净的被有1%，明胶的玻片上，自然晾干。2.5%的戊二醛固定3h2.5%重铬酸钾处理16h新鲜配制的0.3%油红O染色 20min氧化苏木精衬染2min丙酮脱水125s 后PV

25、P封片。各步骤间均用双蒸水冲洗干净。胞浆内出现红染颗粒的为脂质染色阳性。4、U 937细胞透射电镜观察 以1：1(V/V)的比例在每瓶培养细胞中加入2%戊二醛预固定30min，低速离心20min，去上清后制备出细胞团;以每份细胞团与5份2%戊二醛的比例固定细胞。标本送电镜室行透射电镜检查。细胞内脂质在透射电镜下表现为泡。5、泡沫细胞内形态学分析 泡沫细胞内脂质的堆积在形态学上也有相应的改变。光镜下，正常对照组细胞内无明显红染颗粒，而处理组细胞体积增大·细胞浆内可见较多的红染颗粒，提示细胞内脂质成分增加。同样，在透射电镜下，正常对照组细胞浆内无脂质空泡(图20-2左图)，经ox-TLD

26、L处理的细胞胞浆内出现大量的脂质空泡(图20-2右图)。光镜和电镜结果表明o×-LDL处理的细胞胞浆内有大量脂质堆积。 泡沫细胞的生物学特征有二：其一是在形态学上，细胞浆内脂质成分明显增多，并聚集成商，苏木索-伊红染色镜下可见胞浆呈泡沫样改变；其二是细胞内总胆固醇增加，且胆固醇酯占总胆固醇的一半以上。采用人类单核细胞株U937与80mg/L的ox-LDL孵育48h，模型细胞内脂质特别是胆固醇酯明显增加，超过了胆固醇的含量。光镜下处理组细胞经油红O染色胞浆内可见明显的红染的脂质颗粒；透射电镜下处理组细胞内可见大量的脂质空泡，在生化和形态学上符合泡沫细胞的定义。提示成功地建立了人单核细胞

27、源性泡沫细胞模型。用高效液相色谱法检测细胞内微量的胆固醇和胆固醇酯，克服了以往化学和博学方法检测细胞内胆固醇和胆固醇酯的不足，提高了胆固醇和胆固醇酯检测的稳定性和灵敏度在形态学观察上光镜和透射电镜相结合，使实验结果更加直观可靠。以U937细胞株为基础建立的泡沫细胞模型来源于人类的单核细胞，比其他动物源性的如J744巨噬细胞及C57BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞更接近于人体。曾有人用外周血单核细胞来源的巨噬细胞与100mg/L的乙酰化LDL孵育48h后获得人单核细胞来源的泡沫细胞的报道，与本模型使用ox-LDL剂量和时间相近，但本模型使用的是已证明在As斑块内存在的o×-LDL

28、,且避免了个体差异，也避免了从人体取材原代细胞培养的麻烦，能为研究泡沫细胞提供大量稳定可靠的细胞材料；U937细胞无经典的A类清道夫受体，但存在B类清道夫受体CD36，故本泡沫细胞模型有利于研究CD36功能。总之，该细胞模型是在离体细胞水平上建立了As损伤中的一种病理细胞模型，为研究泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块形成的机制提供了新的工具，也为筛选泡沫化相关基因的顺利进行奠定了可靠的基础。(二)THP-1泡沫细胞模型 1、细胞培养 THP-1细胞用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液，在37、5%CO2培养箱中静置培养。培养液中加青霉素和链霉素各1.0× 105 

29、;U/L。在每次实验前用160 nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞24h，使其诱导分化成巨噬细胞。 2、油红O染色 细胞被处理后，1%HCI分色及返蓝后，水性封片剂封片。显微镜下观察，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝色，适用于中性脂肪染色。3.操作步骤(1)将细胞培养于放有消毒盖玻片的6孔培养板内。(2)用PBS洗3次，50%异丙醇固定1min.(3)油红O染色液染色8min，苏木素染色6min.(4)1%盐酸酒精分色。(5)水漂洗10min或于稀碳酸锂水溶液中促蓝，裱于玻片，把周围水分抹干。(6)图像分析系统收集图像并显微镜下摄像。4、染色 结果判定：中性脂肪呈红色，胞核蓝色(图20

30、 3)。5、注意事项（1）用于脂肪易溶于有机溶剂，所以显示脂肪一般不能像石蜡切片一样处理，而通过冰冻切片染色来显示。(2) 作脂肪染色的冰冻切片不能太薄，过薄的切片常会使脂质丢失。(3) Mayer苏木素复染时间不能过长。(4) 染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。(三)小鼠腹腔巨噬细胞泡沫细胞模型 收集巨噬细胞。取C57BL/6J小鼠80只(雄性，10周龄，23g左右)，腹腔注射2ml无血清培养基RPMI1640,96h后注射4ml RPMI1640收集腹膜巨噬细胞，以109/L.密度种植在培养瓶中，每瓶2ml，在37、5%CO2培养箱中培养12h，弃培养液，PBS冲

31、洗未贴壁的细胞组分，重复3次。分别加人4ml的空白对照培养液(含10%胎牛血清的RPMI1640)和10g/ml ox-LDL,孵育96h，可建立腹腔巨噬细胞泡沫细胞模型。(四)血管平滑肌巨噬细胞模型 血管平滑肌细胞的收集与培养：贴壁法收集血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)。行无菌操作取猪胸主动脉，去脂肪组织，PBS和D-Hank液依次冲洗，37以0.25%胰酶消化37min，刮除内皮细胞，剥离中膜，剪碎，组织黏块，置于37、5%CO2培养箱中行原代培养，原代细胞呈融合生长时弃去培养液，D-Hank液冲洗2次，0.

32、125%胰酶消化35min，弃消化液加含20%胎牛血清的M199培养液，自瓶壁刮下细胞，收集培养液，以2× 107/L密度种植于50ml培养瓶。1周后细胞融合，按相同的方法继续传代，传至第35代的细胞铺满后，弃去培养液，PBS冲洗3次，分别加入4ml的空白对照培养液(含20%胎牛血清的M199)，15µg/ml ox-LDL,孵育72h，可建立血管平滑肌源性泡沫细胞模型。 巨噬细胞用0.25%胰酶消化lmin，平滑肌细胞用0.125%胰酶消化5min，收集细胞，以1000r/min离心10min，弃上清，用PBS冲洗1次，加人异丙醇0.5ml，在超声波清

33、洗器震动10秒/次×3次，以1000r/min离心15min。吸上清，分别用总胆固醇、游离胆固醇试剂盒测定总胆固醇及游离胆固醇。离心沉淀物用0.1mol/L NaOH0.5ml裂解细胞，用Lowry法测定细胞蛋白质含量，细胞内胆固醇含量用每克细胞蛋白质所含的总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯来表示，胆固醇酯含量由总胆固醇和游离胆固醇的差值获得(五)乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)制备及鉴定1、LDL的分离 购买健康人血浆，制备低密度脂蛋白，将210ml血浆置超速离心机作序列超速离心。首先4、42 000r/min离心18h，用吸管仔细吸出上层乳白色液体(VLDL)及

34、次层淡黄色液体(IDL)，收集下层液体，然后加入固体KBr 17.9g使最终密度为1.063g/ml，并加血浆密度标准缓冲液使总体积为210ml，再置超速离心机中，于42 000r/min、4下离心20h，用吸管仔细吸出漂浮于离心管顶部橙黄色液体即得LDL。提纯的LDL在含200µmol/L  EDTA的BPS液中透析48h，过滤除菌，BCA法定量蛋白，用PBS液调节蛋白浓度至1mg/ml,4保存。2、LDL的乙酰化修饰 16ml LDL中加人1 ml 0.15mol/l NaCL和1 ml饱和醋酸钠，冰浴中不断搅拌，然后醋

35、酸酐24µl以小液滴 (2¢µl/滴) 形式于冰浴中不断搅拌下1 h内全量加入，加入后继续搅拌30min，将反应溶液移人透析袋中，在Ac-LDL透析液(0.15 mol/l NaCl，0.3mmol/L EDTA)中4透析24 h。过滤除茵，4保存。3、Ac-LDL的鉴定 取氧化和乙酰化前后的LDL，经5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，2.5 %考马斯亮蓝常规染色，脱色后可见清晰的LDL条带，同时采用0.5%琼脂糖凝胶电泳分析。二、胆固醇流入/流出模型(一)Caco-2胆固醇流入/流出细胞模型 Caco-2细胞是

36、一种人结肠癌细胞，其具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接。如主动转运系统：糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B12内源性因子的主动转运载体。酶包括小肠细胞刷状缘的酶、I相代谢酶CYP1A1、相代谢酶谷胱甘肽S-转移酶、-葡萄糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶。由于形态学及生化性质都与小肠上皮很相似，Caco-2细胞模型已广泛的用于体外药物分子肠吸收的研究。 1、Caco2细胞培养 将Caco2细胞种植在一种底部装有聚碳酸酯膜的细胞培养插件(transwell clusters或snapwell，图20-6)上，snapwell小井直径为3cm，snapwell小井放置在六穴组合培养皿中，

37、种植密度约为每个snapwell小井为10×105个细胞。培养液含10%的小牛血清、非必需氨基酸、抗生素 (penicillin 1 × 107 U/L和streptomysin100mg/ L双抗液) 的DMEM (dulbeccos modified eagle medium) 缓冲液。种植后第1周每天换1次培养液，1周后可隔天更换1次。在37的CO2培养箱中培养2128 d，建立Caco-2单层细胞模型后待用。2、胆固醇流入实验 Caco-2单层细胞模型建立后，用无血清的DMEM培养基洗两

38、次，然后用1ml混合胆固醇微胶粒和包含0.5%牛血清的培养基在37'C下共同孵育细胞24h。孵育后，把细胞放置在冰上，首先用包含有1mgBSA/ml的冰冷的PBS(pH7.4)洗两次，然后再用冰冷的PBS(pH7.4)洗两次。用1ml的正己烷：异丙醇 (3 ：2、V： V) 孵育细胞30min来提取细胞胆固醇。剩余的被溶解于0.1mol/L NaOH用于测蛋白质含量，正己烷-异丙醇的萃取液用氮气干燥，烘干后的脂质重新溶解于含有0.5% TritonX- 100的氯仿中。蒸干氯仿后，片状沉淀物重新溶解于水中后用商用试剂盒来确定TC。计算胆固醇流入量

39、。 3、胆固醇的流出实验 细胞用含有10%胎牛血清和0.2UCi/ml中 3H 标记胆固醇的DMEM培养基孵育24h后，用含有1mg/mlBSA的PBS洗3次，然后在含有0.5%BSA的无血清培养基中平衡16h。此后，在37下用未标记的胆固醇微胶粒孵育细胞2h。比较上清液的放射性强度，用闪烁计数法检测培养液中和细胞中的 3H 胆固醇，胆固醇流出用总CPM除以培养液中CPM，再乘以100%来表示。由此来检测胆固醇的流出量。(二)动物整体水平胆固醇吸收与排出模型双标法 1、标记胆固醇混合物 每只田鼠静脉内注射2.5µCi  1，2-3H 胆固醇，溶于20%的脂肪乳中，然后用含MCT油1.o pCi  4-14C 胆固醇灌胃，测定 3H 胆固醇活性时，先氮气吹干，然后重溶于无水乙醇中 (o.5µCi 3 H/µl，再加人未稀释的脂肪乳 (0.16 ml