酵母RNA的提取

1、酵母 RNA 的提取实验目的：1了解从植物、动物等材料中提取有效成分的方法途径，掌握在实验过程中细胞破壁的方法。2. 了解酵母RNA提取的不同方法，掌握稀碱法提取 RNA的技术。二 实验原理：稀碱法使用稀碱（%氢氧化钠）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清夜用乙醇沉淀 RNA或调利用等电点沉淀。三 实验技术：1细胞破壁的方法：（ 1）物理方法：研磨法，组织捣碎器法（低温操作，防止变性），超声波法，压砸法，冻融法。（ 2）溶胀和自溶：溶胀 细胞壁内外存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。自溶 细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下，发生溶解的现象称

2、自溶。（ 3）化学方法：用脂溶性的溶剂或表面活性剂处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种有效成分，导致整个细胞破碎。（ 4）生物酶降解法：如溶菌酶有降解细胞壁的功能。2生物材料的选择：原材料丰富，易得、廉价、有效成分含量高。3溶剂的选择：有效成分溶解度尽可能的大，不发生化学反应，不改变有效成分的化学性质，价格低，成本低，收益高。4影响提取的因素：溶液PH 值，溶剂的极性和离子强度，温度，水解酶，搅拌， 金属离子，抽提液与抽提物的比例要适当，一般5： 15.酵母RNA的提取方法：苯酚法一保存了生物活性，去污剂法，浓盐法，稀碱法。四 试剂：1. %氢氧化钠2. 95%酸

3、性乙醇：500 毫升乙醇加5毫升浓盐酸。3. 95%乙醇4. 无水乙醇五 仪器：离心机、电炉、米浴锅、天平等六 操作：称取 4 克干酵母粉置于200 毫升锥形瓶中，加入40 毫升%氢氧化钠溶液，沸水浴30 分钟，经常搅拌，后流水冷却，4000 转 /分离心15 分钟，取上清液，加入 40 毫升95%酸性乙醇，边加边搅拌，后静置5 分钟，再4000 转 /分离心5分钟，保留沉淀，再用95%乙醇20 毫升洗涤两次，每次洗后3000 转 /分离心5分钟，再用20 毫升无水乙醇分两次洗涤，每次洗后3000 转 /分离心 5 分钟，收集沉淀于滤纸上干燥备用。产量计算：RNA量干酵母粉RNA含量=X 10

4、0%干酵母粉量七 注意事项：1沸水浴要加小漏斗回流，经常搅拌。2离心机的使用，要注意平衡、转速调节由慢至快，对称放置等。3电炉安全使用。4天平使用，称量要注意的问题。紫外吸收法测量 RNA含量一 试验目的：1了解测量核酸浓度不同方法的原理。2掌握紫外吸收法测核酸浓度的原理和技术。二 试验原理：1紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260nm 处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比（0-50 微克 /毫升） ，符合朗伯-比尔定律。优点是样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。2地衣酚显色法：核酸与浓盐酸共热，发生降解，生成糠醛，后者与地衣酚反应，在三价铁离子或二价

5、铜离子作用下，生成鲜绿色的复合物，670nm 处有最大吸收，且光吸收值与浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。缺点是反应特异性差，易受干扰。3定磷法：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中无机磷酸生成磷钼酸，当有还原剂存在时，磷钼酸立即被还原生成蓝色的还原产物-钼蓝，其最大吸收在 660nm 处，当无机磷含量在每毫升1-25微克范围内，光吸收与含磷量成正比。 测量样品核酸的总磷量，需先将它用硫酸或高氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可计算出核酸含量。优点是测量准确，缺点是操作繁琐。三 化学试剂1 .酵母粉 2. %氢氧化钠溶液3. pH1-14试纸4.标准核酸：100微克/毫升四实验仪器1紫外分光光度计2. 精密电子天平五实验操作1 .准确称取克样品核酸，加2毫升氢氧化钠溶液和1毫升水溶解，调成糊状， 再加入50毫升左右水溶解，边溶解边转移到 100毫升烧杯中，用氢氧化钠调 至中性，定容至100毫升，再取2毫升定容至100毫升备用。（开始溶液呈乳白 色，完全溶解后变为澄清透明溶液）2 .制作标准曲线，测定样品：管号标准曲线样品（稀释2次）100倍编号123456789标准RNA9水4311260nmOD浓度ug/ml5102030404524容量瓶中的浓度是2400u