龙葵碱对雄性小鼠遗传毒性实验研究

1、龙葵碱对雄性小鼠遗传毒性实验研究龙葵碱对雄性小鼠遗传毒性实验研究季宇彬1,2王斌1,2 郎朗1,2（1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究发展中心 药物研究所 博士后科研工作站，黑龙江 哈尔滨 150076；2.国家教育部 抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）摘要摘要 目的目的 探讨龙葵碱对小鼠骨髓细胞、精子的毒性作用。方法方法 采用流式细胞仪分析龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的影响；采用微核试验技术观察龙葵碱对小鼠骨髓细胞微核变化的影响；采用精子畸形试验观察雄性小鼠精子畸形率的变化。结果结果 流式细胞仪检测到龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的结果表明，G0/G1期细胞比率随剂量增

2、加而不断升高,S 期和 G2/M 期比率均有下降。这表明细胞被阻滞在 G0/G1期，影响 DNA 的合成，进而影响 G2/M 期，使进入这一期细胞数减少,证明龙葵碱对骨髓细胞周期可产生明显的干扰。微核发生率和精子畸形率随剂量增高而逐渐增加。经统计学处理,高中低剂量组与阴性对照组均有统计学意义(P0.05)。结论结论 在本实验条件龙葵碱对雄性小鼠存在遗传毒性影响。关键词关键词 龙葵碱；细胞周期；骨髓微核；精子畸形Study of solanin on Genotoxicity of male miceJi YuBin1,2,WangBin1,2,LangLang1,2(1. Postdoctor

3、al Research Station, Inistitute of Materia Medica, Life Science and Enviroment Science Research Center, HarBin Commerce University, HeiLongJiang HarBin 150076, china; 2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of National Education, HeiLongJiang HarBin 150076, china)Abstrac

4、t Objective:To explore the toxic effect of solanin on myeloid cell and spermatozoon in male mice.Methods: To analyze the effect of solanine on cell cycle of myeloid cell in male mice by flow cytometer(FCM) assay and to study the effect of solanin on myeloid cell and spermatozoon in male mice by micr

5、onucleus test of myeloid cell and sperm deformity test. Result: G0/G1 pcriod increase, S and G2/M pcriod decrease in solanine group. It indicates that solanin block myeloid cell in G0/G1 phasc to stop the DNA synthcsis and to reduce cell population of G2/M pcriod.Therefore, Solanin is proved to prod

6、uce conspicuous interference on myeloid cell. High-dosage groups medium-dosage groups and low-groups of Solanin all show statistical significance(P0.05) compared with antifertility-dosage groups in micronuclei assay of myeloid cell and sperm deformity test. Conclusion:The genetoxic influence of sola

7、nin on male mice is existed in such experiment condition.KeyWords Solanin; Cell cycle; myeloid cell; sperm deformity龙葵提取物含多种具有抗肿瘤作用有效药理成分，抗肿瘤作用最主要成分为生物碱，龙葵碱又名茄碱，主要存在于茄科植物马铃薯的块茎及龙葵的全草中。龙葵碱有抗肿瘤作用，对动物肿瘤的抑制率极强,有明显的细胞毒作用1。同时龙葵碱也是一种致命毒素，对胃肠黏膜有较强的刺激作用，对中枢神经有麻痹作用，人体吸收过量龙葵碱可引起头痛,腹痛,呕吐,腹泻,瞳孔扩大，心跳先快后慢，精神错乱,昏迷等

8、症，但是龙葵碱并非立即致死，却会慢慢累积在体内。有报道龙葵碱有胚胎毒性可导致孕鼠流产，该类生物碱明显地损害胚胎的生长发育及分化,有极强的胚胎毒性。但是目前,对于龙葵碱在遗传及生殖毒性方面的研究在国内外均少见报道，必要进行这方面的研究，为评价其安全性及保护人类免受龙葵碱的毒性危害提供实验基础和科学依据。本文通过对龙葵碱遗传毒性的观察来探讨龙葵碱对哺乳动物是否有遗传毒性方面的影响。1 1 材料与方法材料与方法1.1 受试物 龙葵碱，纯度为 98%，由黑龙江药品检验所提供。1.2 实验对象 实验动物采用昆明小白鼠,由哈尔滨肿瘤医院实验动物中心提供。1.3 实验方法 细胞周期检测试验 选用性成熟雄性小

9、鼠 60 只,体重 1825g,随机分为 6 组每组 3 只，给药和取材时间同微核试验。将小鼠处死后，取出双侧股骨，去肌肉，擦净血污，剪开两端关节面，用注射器吸 3ml PBS 液冲出骨髓于试管中，滴管吹散，300 目筛网过滤，1000r/min 离心洗涤 10min，弃去上清，将细胞重新悬浮于 PBS 中，镜检，将细胞浓度调整为 1106 /ml。取 1ml 细胞悬液，迅速喷射到预冷的70乙醇中，混匀，4放置过夜。过夜后，离心去除乙醇，加PBS，1000r/min 离心洗涤 10min，2 次。弃上清后余下 0.5ml，加入 1mlPI 染液，37避光染色 30min。流式细胞仪检测，激发光

10、波波长为 488nm,发射光波波长大于 630nm。每份样品选取 10000 个细胞用 Multicycle 进行自动分析。1.3.4 数据统计及处理方法 研究数据采用 SPSS11.5 统计软件建立数据库。均采用方差分析，组与组间采用 LSD 方差分析。 骨髓细胞微核试验 将体重 2026g 的雄性小鼠 30 只随机分为 5 组,每组 6 只,即阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺 40mg/kg)龙葵碱高剂量组 1/2LD50(21mg/kg)、中剂量组 1/4LD50(10.5mg/kg)和低剂量组 1/8LD50(7.25mg/kg)。各组都采用腹腔注射方法，龙葵碱给药组共给药

11、两周。每周按体重调整一次剂量。停药后 24h 处死。阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺 40 mg/kg，采用 30 小时给药法注射 2 天，于第 2 天注射后 6 小时用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，迅速用手术剪将其后肢股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨骺，用带针头的 2ml 注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以 1000rmin 速度离心 10min，弃去多余的上清液，留下约 0.5ml 与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的载玻片上，推片。将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇溶液固定15min，取出晾干。用新鲜配制的

12、 Giemsa 工作液（Giemsa 储备液 1 份加 pH6.8的磷酸缓冲液 9 份）染色 1015min，然后冲洗掉玻片上的染色液，风干。于油镜下每只小鼠计数 1000 个嗜多染红细胞(PCE),观察含有微核的 PCE 数,并计算其微核率。 精子畸形试验 选用性成熟雄性小鼠 60 只,体重 1825g,随机分为 5 组每组 6 只, 阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺 40mg/kg，连续染毒 5 天，第 1214 天处死。除阳性组外各组给药剂量同微核试验。采用连续两周腹腔注射染毒,于停药后 24 小时内处死小鼠。参照改良的小鼠精子畸形实验方法2进行。颈椎脱臼法处死小鼠，分离附睾，分别置于盛有

13、1ml0.9%生理盐水的 24 孔板中，轻轻撕开附睾被膜，缓慢摇晃 24 孔板数次，静置 35min，在悬液中加入 1%伊红溶液 80l 混匀染色 1520min 后，取 1 滴置于清洁的玻片上，均匀推片，空气自然干燥后，用中性树胶封片，油镜镜检。每只动物观察 300 个精子细胞。精子畸变类型包括无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头、双尾、尾折叠等。2 2 结果结果2.1 龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的影响结果可见表 1 图 1， G0/G1期细胞比率随剂量增加而不断升高,S 期和 G2/M期比率均有下降，细胞被阻滞在 G0/G1期，影响 DNA 的合成。龙葵碱各组与阴性组都有显著性差异。表表 1 1

14、 龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的影响龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的影响(xs,n=3)(xs,n=3)Tab1 The effect of solanine on cell cycle of myeloid cell in male miceGroup G0/G1(%) S(%) G2/M(%)Control 65.988.43* 27.937.50* 6.092.03*1/8LD50 80.310.46* 17.010.74* 2.850.58*1/4LD50 82.192.94* 16.803.27* 1.011.02*1/2LD50 82.450.35* 16.780.73* 0.770.81*

15、CP 86.450.59* 12.700.26* 1.140.31*注：*：Compared with negative control P0.01。 Fig.1-1 cell cycle of mices marrow cells in 1/8LD50 Fig.1-2 cell cycle of mices marrow cells in 1/4LD50Fig.1-3 cell cycle of mices marrow cells in 1/2LD50 Fig.1-4 cell cycle of mices marrow cells in CPFig.1-5 cell cycle of m

16、ices marrow cells in control 图 1 龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的影响图谱龙葵碱对小鼠骨髓细胞周期的影响图谱Fig1 The effect of solanine on cell cycle of myeloid cell in male mice2.2 龙葵碱对小鼠骨髓细胞微核率的影响(表 1) 结果可见表 2，图 2，由表 2 可见龙葵碱对小鼠骨髓 PCE 的微核率与阴性对照组比较差异有显著性(P0.05)。表表 2 2 龙葵碱对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率的影响龙葵碱对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率的影响Tab2 The effect of solanin o

17、n micronucleus of myeloid cell 组 别 剂量 动物数 受检细胞数 含微核细胞数 微核率 (mg/kg体重) (只) (个) (个) (，xs)Control 6 6000 45 7.502.8811/8LD50 5.25 6 6000 76 12.671.751*1/4LD50 10.5 6 6000 88 14.672.582*1/2LD50 21 6 6000 109 18.174.401*CP 40 6 6000 167 27.835.115*注：微核率以均数 标准差表示 。Vs control (* p0.01 * p0.05) 胞内微核 胞外微核胞外双核

18、图图2 龙葵碱对小鼠骨髓细胞微核的影响龙葵碱对小鼠骨髓细胞微核的影响Fig 2 The effect of solanin on micronucleus of myeloid cell2.3 龙葵碱对小鼠精子畸形率影响 由表 3 可见,受试物龙葵碱各剂量组的畸形率均高于阴性对照组,经统计学分析,高中剂量组与阴性组有显著性(P0.05),低剂量组与阴性组差异不显著。表表 3 3 龙龙葵葵碱碱雄雄性性小小鼠鼠精精子子畸畸形形发发生生率率的的影影响响Tab3 The effect of solanin on sperm deformity of spermatozoon in male mice

19、组 别 剂量 动物数 受检精子总数 畸变精子数 畸变率 (mg/kg) (只) (个) (个) (，xs)Control 6 1800 84 4.672.8281/8LD50 5.25 6 1800 130 7.227.8401/4LD50 10.5 6 1800 176 9.786.890*1/2LD50 21 6 1800 212 11.786.772*CP 40 6 1800 734 40.7817.072*注：畸形率以均数 标准差表示 。Vs control (*; p0.01 *; p0.05) 正常精子 不定型和双尾 香蕉型 卷曲和无钩 图图 3 3 龙龙葵葵碱碱雄雄性性小小鼠鼠精

20、精子子畸畸形形发发生生率率的的影影响响Fig3 The effect of solanin on sperm deformity of spermatozoon in male mice3 3 讨论讨论流式细胞仪检测技术术是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。应用流式细胞术进行细胞周期检测是研究外来化合物毒作用机制的重要手段。本实验采用 PI 染色,流式细胞仪测定龙葵碱作用于骨髓细胞后的周期变化情况。结果表明，龙葵碱各组与阴性组都有显著性差异。由图 1 可看出 G0/G1期细胞比率随剂量增加而不断升高,S 期和 G2/M 期比率均有下降。这表明细胞被阻滞在 G0/

21、G1期，影响 DNA 的合成，进而影响 G2/M 期，使进入这一期细胞数减少。表明了龙葵碱对骨髓细胞周期可产生明显的干扰，证明 DNA 的合成受到影响。微核实验是检测外来化合物对染色体损伤的重要方法，目前已经在国内外得到广泛应用。微核是细胞的染色体发生断裂后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于 1/3 的，嗜色与主核一致，完全与主核分开的圆形或卵圆形的微小核。各种理化因素包括化学毒性物质损伤、放射线照射以及细胞组成成分缺乏3使细胞的 DNA 复制和染色体的分裂受到破坏，纺锤丝的功能受到影响，产生微核，是染色体畸变在间期中表现出的一种损伤类型，微核

22、率可以反应致畸因素对细胞的损伤程度和染色体的稳定性4。Sato N 等认为微核可以是细胞凋亡的产物，当致畸因素导致凋亡基因激活，内切酶激活，切割 DNA，形成细胞核碎片，最终导致许多微核5。本实验通过对整体遗传水平的小鼠体内骨髓微核实验研究，说明龙葵碱高中低各组与阴性组对比有不同程度的诱变效应。 小鼠精子畸形试验是检测环境化学物质对生殖细胞不同时期诱变性的一种体内实验,由于其对已知的诱变剂高度敏感和对已知的致癌原因有高度的特异性而在国内外毒理学研究工作中广泛应用。精子的成熟是一个依赖于附睾微环境的复杂过程。药物对附睾的影响可能是导致不育的原因之一,但对睾丸精子细胞的作用可能是导致精子数量和活力

23、下降的主要原因，主要是影响精子细胞的变形过程6。本实验结果显示，三个剂量组的精子畸形率均高于阴性对照组，高中剂量组与阴性组有显著性(P0.05),但低剂量组与阴性组差异不显著，说明龙葵碱可以透过血-生殖腺屏障而对生殖细胞-精子的发育造成影响，干扰精子正常形成与成熟，具有生殖毒性。综上所述，本实验通过流式细胞术揭示了龙葵碱确实可以对哺乳动物机体细胞周期产生干扰，使细胞 DNA 合成受到阻滞。在的雄性小鼠骨髓微核和精子畸形组合实验中进一步证实了龙葵碱可以使细胞的 DNA 复制和染色体的分裂受到破坏，具有细胞毒性。 参考文献参考文献1 Gi Y B. Pharmacolog and application of active component in compound traditional chinese medicine(中药有效成分药理与应用)M.Haerbin: Heilongjiang Science and Technology Press, 1995:433. 2 Wei Q，Fan R Q，Yang X F et al.