遗传工程技术

1、9.9 遗传工程技术 遗传工程问世于70年代初。它是按照人们预先设计的生物蓝图，通过对遗传物质的直接操纵，进行改组、重建，实现对遗传性状定向改造的技术。目前采用的基本方法是把遗传物质从一种生物细胞中提取出来，在体外施行“外科手术”，然后再把它导入另一个生物细胞中，改变其遗传结构，使之产生符合人类需要的新遗传特性，定向地创造新生物类型。由于它采用了对遗传物质体外施工，类似工程设计那样，具有很高的预见性、精确性与严格性，因此称为遗传工程。遗传工程包括两个水平的研究：一是细胞水平（如转化、接合和转导等）；另一是基因水平。所以，又可把它分成细胞工程和基因工程。实际上目前研究的主要内容是基因工程，因此，

2、狭义的讲，遗传工程就是基因工程。构建基因工程菌治理环境污染是环境生物工程高新技术的前沿课题。它能定向有效地利用环境微生物细胞中降解污染物的基因，去执行净化污染物的功能。已发现环境微生物具有降解农药、塑料、多氯联苯、多环芳烃、石油烃、染料及其中间体、酚类化合物和木质素等有机污染物的功能及相关的基因。具有降解污染物基因的土著微生物菌株有时难以适应处理环境，而且繁殖速度慢，清除有机污染物的速度和效果达不到治理工程的要求，因此有必要将降解污染物的基因转入繁殖能力强和适应性能佳的受体菌株内，构建出高效菌株用于治理污染或用于建立清洁生产工艺及生产其他利于环境保护的生物制品。例如利用降解石油烃的基因构建出基

3、因工程菌用于清除大面积海洋石油污染，利用木质素降解基因构建成基因工程菌用于建立生物制浆造纸的清洁生产工艺，利用毒性蛋白基因构建基因工程菌生产生物农药等等。一、 治理污染基因工程菌构建的基本过程首先从环境中筛选出具有降解污染物功能的菌株，再从具有降解功能菌株的细胞内分离出具有降解污染物功能的基因片段，经确认鉴定之后作为目的基因使用。在细胞外将目的基因DNA片段与其他来源的载体DNA片段通过一系列酶学反应，重组为新的DNA。DNA重组过程即称为基因操作过程，然后将重组后的DNA分子导入受体菌细胞内。基因工程是70年代初发展起来的。它是在分子水平上，用剪接DNA片段，通过载体（一般用质粒）与同种、同

4、属或异种、甚至异界的基因连接成为一个新的遗传整体，然后再用它感染受体细胞，复制出新的遗传特性的机体的方法。具体过程简述于下：选择合适的供体细胞，将其DNA取出，一般DNA应为双螺旋分子。选择合适外切酶或限制性的内切酶，它能专一地切断供体细胞DNA分子的特定部位，并在切断处形成具有粘着性的末端单链（又称粘接末端）如图55，使DNA分子在体外进行剪接、重组。目前，这类酶已陆续发现几十种，它们的切点各不相同，可以分别选用，并已制成商品出售。基因的运载和复制。大部分DNA片段在细胞内无自体复制能力，所以要选择有自体复制能力的质粒（如R因子，降解质粒等）或病毒（如入噬菌体、SV40病毒等）作为载体。取出

5、体称载体DNA，也用内切酶将其切断并形成粘性末端。在DNA连接酶的作用下，将供体细胞DNA粘性末端与载体细胞DNA粘性末端粘着起来，相应的互补碱基对以氢键相联，形成一个新的重组的载体DNA分子。将重组的载体DNA分子加入受体细胞培养液中，受体细胞吸入载体，载体在细胞内复制，使受体细胞以及后代获得原供体细胞的基因和相应的新的属性。整个过程如图56所示。图55 DNA分子的剪切图56 基因工程菌构建的基本过程图解二、转化细胞的筛选与鉴定 目的基因是否已转入受体细胞必须通过严格鉴定才能确认。目的基因DNA片段是否存在于受体细胞内，一般可通过联合使用分子杂交技术、基因体外扩增技术和基因DNA序列分析技

6、术进行鉴别。测定目的基因分子杂交技术称为Southern印迹法。它是根据目的基因DNA碱基数量和顺序，人工合成含有放射性元素标记的相应DNA片段即分子探针，分子探针的DNA片段能与目的基因的DNA片段发生互补反应，反应的产物能在胶片上留下放射性元素感光的痕迹，以此确证与分子探针互补的DNA即为目的基因。基因体外扩增技术的应用是为了增加目的基因的数量，使分子杂交试验的结果更为明显。DNA序列测定是直接测试转化细胞中目的基因DNA片段的碱基数量和顺序。如果测得的DNA片段中碱基数量和顺序与分子克隆的目的基因DNA片段吻合，即可判定目的基因确实存在于转化细胞内。作为受体菌，一般选择对人类无害，繁殖能

7、力强，生长速度快的微生物作为执行目的基因功能的使者，如大肠杆菌、枯草杆菌等。三、目的基因的表达 降解污染物基因经确认存在于转化细胞内，但并不等于该转化细胞就一定能执行表达目的基因的功能。构建基因工程菌的最终目的是为了降解污染物或生产有用物质。目的基因的表达不仅受到重组DNA分了内启动子等调控单元的控制或受到细胞内其他因素的影响，而且受到外界环境因素的干扰。因此，在分子克隆成功之后，研究目的基因的表达已成为基因工程中又一关键性环节。相关的基础研究和配套的工程技术需要投入相当的经费、技术、人力和时间。四、连续发酵与追踪考察 在实验室内确认转化菌具有高效表达功能之后，一般应用连续发酵自控反应技术使获

8、得的基因工程菌增殖并制成产品，用于具体的污染治理现场。基因工程菌具有功能定向的特征，对其性能稳定性、遗传稳定性和生态学安全性需要进行跟踪考察，经严格的鉴定之后，方可正式用于相应的环境微生物工程中。 治理污染基因工程应该包括从污染物降解菌株的筛选与目的基因的分离到工程实施与技术鉴定的全过程。而基因工程菌的构建即分子克隆操作仅仅是其中的中心环节。五、遗传工程在水污染及环境工程中的应用 由于新的化学物质不断发现，每年约有30万种新的物质问世，其中微生物难降解的污染物日益增多，致使废水处理日趋复杂，为了解决这个问题，各国科学工作者正试图利用遗传工程新技术，把具有降解某些特殊物质的质粒剪切后，连接到受体

9、细胞中，使之用以处理污水中难降解的物质。这种用人工方法选出的多质粒，多功能的新菌种称“超级细菌”。这方面的研究工作，现举几例如下：1. 降解石油的超级细菌70年代美国生物学家查克拉巴蒂（Chakrabarty）针对运输石油，使湖泊、江、海面造成溢油，水面浮油影响水生物，破坏水或生态的情况，研究、开发出这项技术。当时已知许多微生物有降解原油中某种成份，并依此生长的能力。但是原油组成复杂。内含各种脂肪烃、芳烃、环烷烃和多环芳烃等。通常一种菌仅具有氧化少数几种烃能力。如酵母仅能氧化脂肪烃。另外的微生物如假单胞菌、节杆菌及不动杆菌等也可降解原油中的一些成份。如将它们混合培养在一起进行原油降解，则由于原

10、油组分复杂，各组分降解难易程度各异，不同菌种对石油组分的利用性又差别很大，因降解过程十分缓慢。为此考虑将各菌种所含降解烃的质粒移入到一个菌株中去。经研究比较，选择铜绿色假单胞菌PAO（Pseudomonas aeruginosa）作为各种质粒的受体细胞，因为它既可降解16烷以上的烷烃，又可生活在污水环境种，并且可以转化接受同属各种的质粒。恶臭假单胞菌（P.putida）AC59携带CAM-OCT质粒，能在巳烷、辛烷和、癸烷中生长，但在十二烷和十四烷中生长慢，CAM质粒还具有降解萜、菠烃及各种异构体的作用。另一菌株AC63在巳烷及辛烷中生长慢，在十二烷和十四烷中生长良好，它携带DOD质粒。把以上

11、三种质粒全部转入铜绿色假单胞菌PAO中，这个菌株能降解C68直链脂烃及环烃。又以类似方法将能降解甲苯、二甲苯及三甲苯衍生物的质粒XYL转入铜绿色假单胞菌。此时该铜绿色假单胞菌便成为带有多种质粒的“超级细菌”。它具有降解直链脂肪烃、芳烃、萜烃及多环芳烃的能力，可去除原油中的三分之二烃类。浮油在一般自然条件下降解需1年左右时间，用了“超级细菌”只需几小时即可把原油去除。2. 降解染料的质粒1983年瑞士科学家Kulla发现有两种假单胞菌，具有降解印染废水中两种染料的能力。其一为假单胞菌K24，具有降解1号橙偶氮染料的质粒；其二为假单胞菌K46具有降解2号橙偶氮染料的质粒。他把两个菌株进行质粒接合，

12、形成具有产生两种酶的细菌细胞。结果该细胞可获得具有降解两种染料的新菌株。3. 分解尼龙寡聚物的微生物尼龙寡聚物在化工厂污水中难被降解。已发现黄杆菌属（Flavobacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和产碱杆菌属（Alcaligenes）具有分解尼龙寡聚物的质粒。但此三个菌株不易在污水中生长，而污水中能生长的大肠杆菌却无降解尼龙寡聚物的能力。有人将分解尼龙寡聚物的POAD2基因移植到大肠杆菌中，使大肠杆菌获得降解尼龙寡聚物的能力。该基因工程操作步骤如下：从黄杆菌内提取质粒POAD2，同时在大肠杆菌内提取质粒PBR322（具抗四环素和抗氨基青霉素性质）。提取的方法是常规的质粒DNA提取法。用限制性内切酶Hind，分别酶解POAD2