毕业论文罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮(冯仕芬)

1、 本科毕业论文（设计）本科毕业论文（设计）小分子荧光探针的合成及其对特定小分子荧光探针的合成及其对特定金属离子的选择性研究金属离子的选择性研究 学学 院：化学与化工院：化学与化工 专专 业：分析化学业：分析化学 班班 级：级：20072007 级级 学学 号：号：070701110109070701110109 学生姓名：冯仕芬学生姓名：冯仕芬 指导教师：牟兰指导教师：牟兰 2011 年 06 月 02 日贵州大学本科毕业论文（设计）贵州大学本科毕业论文（设计）诚信责任书诚信责任书本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文（设计） ，是在导师的指导下独立进行实验研究所完成。毕业论文（设计）中凡引用他人

2、已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。特此声明。 论文（设计）作者签名：冯仕芬 日 期： 2011.6.10 目录摘要.5Abstract.5第一章 前言.61.1 分子荧光产生的原理.61.2 荧光探针技术.71.3 罗丹明类荧光探针的研究进展.81.4 本文研究背景及工作内容.12第二章 实验部分.142.1 仪器.142.2 试剂以及标准溶液.142.3 实验方法.152.3.1 配制溶液.152.3.2 光谱分析.152.3.3 荧光量子产率的测量方法.152.4 实验步骤.152.4.1 溶剂比例的选择.152.4.2 缓冲溶液的用量.152.4.3 pH 的选择.

3、162.4.4 探针 1 对金属离子的选择性.162.4.5 共存离子对探针 1 和 Fe3+、探针 1 和 Cu2+的干扰效应.162.4.6 job 法测探针 1 和 Fe3+、探针 1 和 Cu2+的作用比.162.4.7 摩尔法测探针 1 和 Fe3+、探针 1 和 Cu2+的作用比.162.4.8 液相色谱法分析探针 1 和金属离子的作用.172.4.9 红外光谱测定和核磁谱测定.172.4.10 探针 1 检测的 Fe3+分析参数.1717第三章 实验结果与讨论.183.1 溶剂比例的选择.183.2 pH 的选择.193.3 缓冲溶液的用量选择.203.4 探针 1 对金属离子的

4、选择性.203.5 共存离子对探针 1 和 Fe3+、探针 1 和 Cu2+的干扰效应.213.6 job 法和摩尔比法测探针 1 和 Fe3+、探针 1 和 Cu2+的相互作用比.223.7 探针 1 检测的 Fe3+、Cu2+分析参数.223.8 光谱分析.233.9 可逆性分析.243.10 样品测定.253.11 结论.25参考文献.27致谢.28小分子荧光探针的合成及其对特定金属离子的选择性研究小分子荧光探针的合成及其对特定金属离子的选择性研究 摘要摘要设计合成具有探针性质的小分子席夫碱罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮，利用核磁、质谱、红外光谱、元素分析以等技术对目标化合物结构进行表征。在目标

5、化合物的乙醇-水缓冲溶液中，加入Fe3+和Cu2+后能诱导罗丹明基团螺环结构开环，形成金属配合物。加入Fe3+观察到显著的荧光增强并具有较高的选择识别性能；同等条件下加入Cu2+ 可以观察到紫外吸收增强并具有较高的选择性能。色谱及光谱分析证实了配合物的形成。竞争实验显示识别响应为可逆过程。关键词：苯基酰肼缩苯甲酰丙酮；罗丹明B衍生物；荧光-比色探针；Fe3+配合物；Cu2+配合物。The recognition properties for Fe3+ and Cu2+ of a new Rhodamine B Schiff-base AbstractA simple structure rho

6、damine fluorescent derivative was synthesized facilely by one step condensation reaction of rhodamine B ethylenediamine and phenyl-acetylacetone. Its structure was characterized by NMR, IR and Elemental analysis. In the ethanol aqueous medium (4:1, V:V, Tris-HCl buffer, pH=6.5), the presence of Fe3+

7、 induced the formation of a 1:1 complex of Fe3+-1, observing significant enhancement of fluorescence and absorption.Besides, In the ethanol aqueous medium (4:1, V:V, Tris-HCl buffer, pH=6.5), the presence of Cu2+ induced the formation of a 1:1 complex ofCu2+-1, observing significant enhancement of u

8、ltraviolet and absorption.And it displayed high recognition properties for the detection of Fe3+ and Cu2+ .The results show that the derivative not only a good fluorescence and colorimetric chemosensor for Fe3+ and Cu2+, but also a metal complex fluorescent probe for BSA. Keywords: Phenyl-acetylacet

9、one; Rhodamine B derivative; Fluorescent and colorimetric chemosensor; Fe3+ complex；Cu2+ complex第一章第一章 前言前言1 1. .1 1 分分子子荧荧光光产产生生的的原原理理荧光分析法是一种灵敏度极高的光谱分析方法，具有荧光寿命、荧光量子产率、激发峰波长等多种参数，因而具有较好的选择性。16 世纪西班牙内科医生和植物学家 N.monardes 第一次观察记录了荧光现象。17 世纪 Boyle 和Newton 等科学家再次观察到荧光现象，并给予了较为详细的记录。直到 1852年 Stokes 在考察奎

10、宁和叶绿素的荧光时，首先确定和报告了他们的荧光波长总比激发波长要长。他通过研究荧光强度和荧光物质浓度的关系，发现在高浓度时荧光会猝灭，在外来物质的作用下荧光也会猝灭，从而建议利用荧光作为检测手段。在紫外可见光的照射下，某些分子吸收特征频率的光子后由电子基态振动能级跃迁到电子激发态振动能级，然后先以非辐射的形式释放能量，回到最低激发态最低振动能级，最后以光辐射的方式释放剩余的能量回到基态，此时发出的光即为荧光。电子能态具有基态和激发态两种，各能态又具有单重态和三重态两种类型。S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或l。S为0时，分子内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单重态，大

11、多数有机物分子的基态是处于单重态。分子吸收光能后，电子由低能态跃迁到高能态，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态。S1，S2，S3.分别表示分子的基态和第一，第二.激发单重态，能量由低到高。如果处于基态单重态的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋方向的变化，那么在激发态分子轨道中的两个电子自旋不配对，此时S=1。分子处于激发态的三重态，用T表示，T1，T2分别表示三重态的第一第二激发态。分子中的电子从基态S0跃迁到激发态S1，S2比较容易发生，速度很快(约10-4s)，而从基志单重态到激发三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子(如S2)可以与其它同类分子或溶剂分子碰撞通过内转换回到激发态的最低

12、能级Sl，这一过程为10-12 s，处于激发态最低能级的分子寿命一般为10-410-8 s，它们会释放出光子而返回到基态，这时产生的光就是荧光。从Sl到Tl能量转化是系间跨越。从Tl到S0有两种过程：一个是能量的释放；另一个是放出光子，即磷光，在10-410s间完成。处于激发态的分子，可以通过不同途径（振动弛豫，内转换，外转换，系间跨跃，荧光发射，磷光发射)回到基态，哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快，则荧光发生几率高，强度大。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢，则荧光很弱或不发生。产生荧光的条件：第一个必要条件是该物质

13、的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常应该具有共轭结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光量子效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。1.2 荧光探针技术分子识别是自然界一切生命现象的共同基础,是有目标的结合,它是通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程1。识别过程可能引起体系的光学、电学、颜色等性质的变化，这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理。在分子识别领域中，具有分子器件性质的荧光探针通过与目标物质选择性键合,结合前后的很多荧光参数发生变化。这种微观领域的相互作用通过荧光信号表现出来,从而实现在分子水平上的原位实时检测2，达到对金属离子

14、、有机分子、生物大分子等很多物质的特效识别。由于荧光分析的高灵敏和高选择性，并能提供丰富的光谱信息，在分析化学、生物化学、环境科学、材料科学、医药等领域具有广泛的应用前景。利用探针分子与非荧光或弱荧光物质以共价或其他形式结合形成发荧光的络合物或聚集体进行测定，即所谓“荧光探针”技术。它是一种利用探针化合物的光物理和光化学特征，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。在医药学上，荧光探针可用于标记蛋白质分子、检测 DNA，可应用于肿瘤学、免疫学、血液学、药物学、临床检测等方面。探针分子的识别性能主要受其分子结构的影响，通过从分子骨架、配位原子及发光基

15、团的选择设计来提高响应的专一性，利用配合物形成的离子诱导及竞争结合等荧光增强机理实现响应灵敏度的增强。经过结构修饰，改善了探针分子的整体结构，从而改善传统荧光染料在选择性、适应性方面的不足，使其具有更高灵敏度、更高选择性和可靠性，更加有利于分析检测。荧光探针通常是由荧光基团和识别基团(受体)两部分组成。荧光基团是荧光探针分子的最基本组成部分，用于将客体的识别信息转化为荧光信号的作用。荧光识别基团必须含有一定的共轭度，因为共轭双键使其容易吸收激发光，其激发波长多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区，所以共轭 键的存在使其发出强而稳定的荧光。具萘、蒽、芘、对苯二醌、苯并杂环及含有呫吨酮的

16、基团等是常见的荧光基团。有些有机荧光分子本身就可以与金属离子配位形成配合物，并表现出显著的荧光变化，这些荧光分子可直接作为探针使用，如 8-羟基喹啉。识别基团(受体)通过与目标物质选择性的键合，再将这种微观领域的作用通过荧光信号表现出来，从而达到某些离子或分子的特效识别。金属离子、有机分子、生物大分子(如多肽、蛋白、核苷酸)等很多物质都可以用荧光探针方便快速地检测。部分受体与金属离子的选择性结合主要由杂原子(氧，硫，氮等)与金属离子的配位作用，和受体分子孔穴的相对尺寸决定。受体空腔及杂原子的不同，表现出对不同的金属离子显著的选择性。荧光分子探针中常用的识别基团有冠醚3、开链聚醚4、多乙烯多胺5

17、、环糊精6、杯芳烃7、多肽等。作为荧光探针应该具有以下特点8：第一，荧光探针的荧光必须与被测样品的背景荧光易于区别；第二，荧光探针必须不干扰研究的主体；第三，荧光探针主要用于生物活体或在天然生物条件下的体外样品的研究，所以荧光探针的毒性、使用的pH范围，生物相容性等方面都有严格的要求。 目前常见的金属离子荧光试剂主要有席夫碱、冠醚、荧光素、罗丹明、腙类、蒽酮类、羟基哇啉等类型。探索设计与合成具有分子探针和分子光开关功能的新型分子传感材料，研究其识别性质，具有重要的科学意义和广阔的应用前景。分子传感器是分子识别研究的一种应用形式，在环境或生物微观系统的组织和结构探索方面有着重要应用前景，成为当今

18、分析化学领域中最有生命力和探索空间的研究热点之一。荧光传感器以其灵敏度高、使用方便、对客体的高度选择性识别等优点成为各种分子、离子的重要检测手段。1 1. .3 3 罗罗丹丹明明类类荧荧光光探探针针的的研研究究进进展展罗丹明是一类咕吨类染料，由于在不同的pH介质中会结合质子而呈阳离子状态存在于溶液中，所以也称罗丹明染料为碱性染料。其中最著名的是罗丹明B，除此之外，还包括罗丹明G，罗丹明123，罗丹明110。罗丹明B具有高的摩尔吸收系数和较大的荧光量子产率，水溶性好，无毒，制备成本低等优点。因此，罗丹明B及其衍生物是一类较好的荧光探针，在研究生物分子结构及功能，核酸杂交分析和免疫等方面得到广泛的

19、应用。由于分子内苯环间是以氧桥的连接，使分子具有刚性共平面结构，分子结构稳定性增强，在激发光的作用下产生强烈的荧光。在可见光区，它们是一类非常好的荧光染料。其单体水溶液能发出很强的荧光，在不同的溶剂、pH值、温度和浓度条件下，罗丹明染料在溶液中主要有以下几种存在形式：中性分子、离子形式、内酯、二聚体或四聚体。如图1所示，罗丹明B在酸性条件下，以醌式(quinone form)结构存在，有荧光，而在中性或碱性条件下，形成螺环(spirolaetam form)结构，荧光减弱至消失。ONORNR2R2NONR2R2NOH-OH-closed form式 式 式 式open form式 式 式 式O

20、NR 图1近年来，罗丹明的内酰胺螺环状结构成为研究的热点：罗丹明的内酰胺螺环状结构，在长波长处无荧光吸收，无色：如果改变内酰胺螺环状结构，它的荧光性质发生改变，即在长波长处有强的荧光吸收，有颜色。由于罗丹明类化合物结构具有易修饰的特点，罗丹明内酰胺类化合物具有形成“OFF-ON型荧光探针的潜能。一般以罗丹明作为母体进行设计，使它形成具有酰胺螺环状结构的化合物，此时它是在长波长处无吸收，无色，无荧光，当它与底物相互作用的时候，内酰胺螺环状结构被破坏而打开，这时它在长波长有吸收，有颜色，强荧光。利用此原理对罗丹明进行设计合成探针分子，此类探针已被用于许多金属离子、生物活性物质及生物分子的检测。罗丹

21、明内酰胺类荧光探针对金属离子的选择性识别，实质就是金属离子与探针分子产生络合作用，诱导探针的螺环结构打开，从而产生荧光信号。此类探针的诱导开环机理存在两种形式：一种是不可逆开环，金属离子通过与探针分子络合诱导螺环打开，从而发生化学反应，形成新的能发出荧光信号的化合物。另一种是可逆开环，通过金属离子与探针分子络合，诱导螺环打开，形成发出荧光的醌式结构，如有更强的络合剂与金属离子结合，此过程则向逆方向进行。ONORNR2R2NguestONORNR2R2Nclosed form式 式 式 式open form式 式 式 式2007年，Xiang 等研究发现室温下罗丹明B酰肼在酸性条件下可用于检测C

22、r6+的浓度，检出限低，样品检测实验结果表明，此探针对于饮用水中Cr6+含量的的检测具有重要应用。 图1.2 罗丹明B内酰胺(RBH)的结构式 Yu Xiang, Ling Mei, Na Li, Aijun Tong, Sensitive and selective spectrofluorimetric determination of chromium(VI) in water by fluorescence enhancement. Analytica Chimica Acta 581 (2007) 1321362009年，Chen等设计合成了探针2，该探针对Cu2+具有较高的选择性和

23、灵敏度识别。并通过加入竞争性试剂，证明该过程是不可逆的。1.Chen X Q, Jia J, Ma H M, Wang S J, Wang X C. Characterization of rhodamine B hydroxylamide as a highly selective and sensitive fluorescence probe for copper(II)J. Analytica Chimica Acta, 2009, 632: 9-142005年，Jinsung Tae12等人利用汞离子催化氨基硫脲形成1, 3, 4-噁二唑酮的原理合成一种新的荧光探针，可用于检测汞离子

24、。该荧光探针具有较快的响应时间，向溶液中加入汞离子后，溶液瞬间变成红色，并产生黄色的荧光。Zhang等 以罗丹明6G为基础，研究合成了探针8。Fe3+的加入引起罗丹明的螺环结构打开，体系呈现出明显的荧光增强。 Lizhu Zhang, Jiangli Fan, Xiaojun Peng,X-ray crystallographic and photophysical properties of rhodamine-based chemosensor for Fe3+. Spectrochimica Acta Part A 73 (2009) 3984022006年，Chunying Duan1

25、3等人在罗丹明6G酰肼上接上吡啶醛实现了选择性检测汞离子。2007年，Yoon14等人设计合成尿素基团的罗丹明衍生物9和10，在乙腈溶液中成功的选择性识别了汞离子。1997年，Czarinik15等合成了罗丹明B酰肼，其可以选择性识别铜离子，该荧光探针是基于铜离子催化罗丹明B酰肼水解生成强荧光的罗丹明B分子的。2006年，Aijun Tong16等人合成水杨醛罗丹明B酰腙，可以可逆性的荧光增强识别铜离子。也就是说，在缓冲溶液中，当加入铜离子时，内酰胺螺环状结构被打开，吸收和荧光增强，当加入络合剂EDTA时，化合物表现出没有吸收和荧光，而在此时再加入铜离子，荧光恢复。2006年，Tong17等人

26、利用二乙基三胺将两个罗丹明B连接起来，从而形成无色，没有荧光的罗丹明B的衍生物，三价铁离子的加入，导致其内酰胺结构的开环，荧光增强，从而实现了对三价铁离子的检测。2007年，Tae和Bae18等人用两步简单合成的探针18，以羟甲氧基为识别基团的罗丹明衍生物。据介绍，羟甲氧基基团能够调节罗丹明内酰胺的开环与闭环之间的平衡，加入Fe3+离子，荧光强度快速增加而且溶液为紫红色。基于罗丹明的闭环(OFF)到开环(ON)这个机理，同年Huang19等人合成了罗丹明酰腙衍生物19，成功的识别Fe3+离子，而且能检测细胞中的Fe3+。2007年，weisheng Liu20等设计合成了两个修饰罗丹明的探针，

27、能够分别在纯水中高选择性的识别Fe3+和Cr3+，包括Cd2+在内的其它离子都没有干扰。从以上的文献综述中，可以发现，经修饰的罗丹明类探针一般都具有较高的选择性、灵敏性。此外，在分子识别的过程中，此类探针的识别性质不仅可以通过荧光信号来进行检测，而且伴随识别过程其吸收颜色会产生红移，进入可见光范围内，因此这类探针还可以用作比色化学传感器，通过“肉眼”来进行检测。更具发展前景的是，此类探针的荧光分子开关性质，它们可以用来检测生物活性细胞内的金属离子，在研究金属离子的生物效应方面有着广阔的应用前景。1.41.4 本文研究背景及工作内容本文研究背景及工作内容铁是地壳中含量排名第二位的金属，是生物系统

28、中最重要的金属之一。三价铁是构成蛋白、细胞色素和多种酶的基本元素，对细胞的新陈代谢起着至关重要的作用。对血液、生物组织等样品中微量铁离子的精确测定是研究其吸收代谢机制的基础。设计结构简单、性能优越的铁离子探针以满足各种测试的需要。本实验主要是设计合成了一种小分子荧光探针罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮：通过苯甲酰丙酮与罗丹明酰肼的分子间缩合反应，一步合成了结构简单的罗丹明内酰胺类荧光探针。研究了探针对Fe3+可见吸收增强和荧光增敏的响应性能，并用多种方法探讨了Fe3+和Cu2+探针配合物的形成，对探针的传感性能进行了考察。1在不同的 pH 值条件下，罗丹明类荧光探针表现出不同的性质。在酸性条件下，由于罗

29、丹明开环引起强烈的质子化，罗丹明类荧光探针呈现出显色现象及明显的荧光增强效应，而在中性及碱性条件下时，颜色及荧光强度均无明显的变化。因此 pH 值的选择对于罗丹明类荧光探针的识别性质起着至关重要的作用。本文中通过条件实验选择了探针的最佳 pH 值及溶剂比。2. 在上述选定的最佳条件下，通过荧光光谱及紫外可见吸收光谱分别考察了探针对金属离子识别的选择性，用等摩尔连续变化法及摩尔比法研究了探针与金属离子的作用比，测定了探针对金属离子检测的线性范围及检出限等分析参数，并且考察了其他金属离子共存对此探针响应的影响。3. 通过实验观察探针和探针-金属离子体系的1H NMR 谱图、红外特征光谱、液相色谱分

30、别探讨了探针识别金属离子的作用机理，推测了配合物形成的作用模式。4. 研究了探针体系与牛血清蛋白的相互作用。小分子荧光探针罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮的合成及其小分子荧光探针罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮的合成及其传感性能的研究传感性能的研究摘要摘要 设计合成具有探针性质的小分子席夫碱罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮，利用核磁、质谱、红外光谱、元素分析以等技术对目标化合物结构进行表征。在目标化合物的乙醇-水缓冲溶液中，加入Fe3+和Cu2+后能诱导罗丹明基团螺环结构开环，形成金属配合物。加入Fe3+观察到显著的荧光增强并具有较高的选择识别性能；同等条件下加入Cu2+ 可以观察到紫外吸收增强并具有较高的选择性能。色谱及

31、光谱分析证实了配合物的形成。竞争实验显示识别响应为可逆过程。关键词关键词：苯基酰肼缩苯甲酰丙酮；罗丹明B衍生物；荧光-比色探针；Fe3+配合物；Cu2+配合物。前言前言分子识别是自然界一切生命现象的共同基础,是有目标的结合,它是通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程1。识别过程可能引起体系的光学、电学、颜色等性质的变化，这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理。在分子识别领域中，具有分子器件性质的荧光探针通过与目标物质选择性键合,结合前后的很多荧光参数发生变化。这种微观领域的相互作用通过荧光信号表现出来,从而实现在分子水平上的原位实时检测2，达到对金属离子、有机分子、生物大分子

32、等很多物质的特效识别。由于荧光分析的高灵敏和高选择性，并能提供丰富的光谱信息，在分析化学、生物化学、环境科学、材料科学、医药等领域具有广泛的应用前景。目前常见的金属离子荧光试剂主要有席夫碱、冠醚、荧光素、罗丹明、腙类、蒽酮类、羟基哇啉等类型。由于罗丹明类荧光探针最大吸收和发射波长较长，受样品背景干扰相对较少，因而罗丹明荧光衍生物在荧光标示与识别领域得到了广泛应用3,4。其对金属离子的选择性识别大多是通过金属离子与探针分子产生络合作用，诱导罗丹明的螺环开环，从而伴随光谱信号变化5。对过渡金属、重金属离子响应的荧光增强型罗丹明类探针已有报道6-10。有利用二乙烯三胺联接罗丹明基团得到的双罗丹明结构

33、的对 Fe3+响应的探针11；或通过罗丹明与氨基吡啶缩合得到对 Fe3+及过渡金属离子响应的探针12；也有用罗丹明 6G 的乙二胺衍生物与水杨醛缩合，再经还原后得到罗丹明氨基酚衍生物的 Fe3+响应探针13。探索设计与合成具有分子探针和分子光开关功能的新型分子传感材料，研究其识别性质，具有重要的科学意义和广阔的应用前景。探针分子的识别性能主要受其分子结构的影响，通过从分子骨架、配位原子及发光基团的选择设计来提高响应的专一性，利用配合物形成的离子诱导及竞争结合等荧光增强机理实现响应灵敏度的增强。经过结构修饰，改善了探针分子的整体结构，从而改善传统荧光染料在选择性、适应性方面的不足，使其具有更高灵

34、敏度、更高选择性和可靠性，更加有利于分析检测。分子传感器是分子识别研究的一种应用形式，在环境或生物微观系统的组织和结构探索方面有着重要应用前景，成为当今分析化学领域中最有生命力和探索空间的研究热点之一。荧光传感器以其灵敏度高、使用方便、对客体的高度选择性识别等优点成为各种分子、离子的重要检测手段。本实验主要是设计合成了一种小分子荧光探针罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮：通过苯甲酰丙酮与罗丹明酰肼的分子间缩合反应，一步合成了结构简单的罗丹明内酰胺类荧光探针。研究了探针对Fe3+可见吸收增强和荧光增敏的响应性能，并用多种方法探讨了Fe3+和Cu2+探针配合物的形成，对探针的传感性能进行了考察。1 实验部分实

35、验部分1.1 仪器与试剂仪器与试剂Varian Cary Eclipse 荧光分光光度计；Amersham Biosciences Ultrospec 5300 pro 紫外-可见分光光度计；Bruker Vertex 70 FT-IR红外光谱仪；Varian Nova-400核磁共振波谱仪；Agilent LC/MSD质谱仪；BAS EC Epsilon电化学分析仪，使用静汞电极为工作电极，铂丝为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极。Shimadzu LC-20A HPLC仪，SPD-M20A二极管阵列紫外检测器，320 nm为检测波长，ODS-SP 柱 (5 m, 4.6250 mm)，流动

36、相为95%甲醇-水溶液；Bruker Smart Apex2 单晶衍射仪；X-5型显微熔点测定仪（温度未校正） 。牛血清蛋白(BSA , Solarbio Company)，所有药品均为分析纯，金属离子溶液由其硝酸盐或盐酸盐配制。实验用水为二次蒸馏水。1.2 罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮的合成罗丹明类探针可由罗丹明芳环修饰或通过罗丹明内酯缩合生成内酰胺，酰胺再与醛缩合得到席夫碱。本文以罗丹明酰肼与苯甲酰丙酮一步缩合生成目标产物。合成线路如图 1 所示。OOreflux 24h1OEt2NNEt2NOCH3ONOEt2NNEt2NONH2图 1称取罗丹明酰肼(2.0 g，4 mmol)，苯甲酰丙酮(0

37、.74 g，4 mmol)，量取无水乙醇 100 mL，加至 250 mL 的圆底烧瓶中，在氮气氛围下搅拌回流反应 24 h。反应完全后，减压浓缩反应液，冷却后过滤得黄色固体。将该固体用氯仿/乙醇重结晶，得 1.8 g 浅红色化合物(1)，产率 68 %。1H NMR (400MHz, CDCl3) : 1.17(t, 12H, NCH2CH3), 1.67(s, 3H, CCH3), 2.09(s, 2H, CH2CO), 3.343.39(m, 8H, NCH2CH3), 5.68(s, 1H, ArH), 6.376.39(d, 3H, ArH), 6.506.52(d, 2H, ArH

38、), 7.197.21(d, 1H, ArH), 7.347.38(m, 2H, ArH), 7.41 (s, 1H, ArH), 7.567.65(m, 2H, ArH), 7.727.74(d, 2H, ArH), 7.947.95(d, 1H, ArH), 11.63(s, 1H, HC=N); IR (KBr) : 3137cm-1, 2967cm-1, 2929cm-1, 1713cm-1; ESI-MS m/z: (ESI: 617.7 M+H+, 638.7 M+Na+). Anal. calcd for C40H44N4O3: C 76.0, H 7.19; N 9.08, O

39、 7.78; found(%):C 76.05, H 7.16; N 8.90, O 7.64.1.3 实验方法实验方法1.3.1 标准溶液的配置探针储备液(1.0010-4 molL-1)：称取6.0 mg化合物，乙醇溶解，配制成100 mL溶液。 Fe3+储备液(2.0010-3 molL-1)：称取80.8 mg Fe(NO3)39H2O，二次蒸馏水溶解，配制成100 mL溶液。 Cu2+储备液(2.0010-3 molL-1)：称取48.32mgCu(NO3)2.3H2O，二次蒸馏水溶解，配制成100 mL溶液。 其他金属离子均配制成二次蒸馏水溶液(2.0010-3 molL-1)。

40、Tris-HCl乙醇-水缓冲溶液(4.010-3 molL-1, pH=6.5)：取0.004 molL-1Tris及适量的HCl相混合，调节pH值至所需。配制1.010-4 gmL-1的BSA标准溶液备用，BSA标准液在04冰箱中保存。1.3.2 测量过程测量过程在10.0 mL容量瓶中依次加入探针储备液(1.0010-4 molL-1，08.0 mL)， Tris-HCl 缓冲溶液(4.0010-3 molL-1，1.0 mL)，Fe3+储备液(2.0010-3 molL-1，08.0 mL)、Cu2+储备液(2.0010-3 molL-1，08.0 mL)及其他金属离子。用乙醇-水溶液(

41、1/4，V/V)稀释至刻度，摇匀，放置一定时间，测量荧光和吸收光谱及强度。荧光光谱测定的激发/发射波长为557/577 nm。1.3.3 荧光量子产率的测量方法荧光量子产率的测量方法以罗丹明B为标准，浓度为0.1 gmL-1（2.0810-7 molL-1） ，在557 nm的波长下，控制体系pH为6.5左右，分别测量待测物（5.0010-5 molL-1探针，9.0010-5 molL-1 Fe3+）和标准物的荧光积分面积和该波长下紫外吸收的吸光度。由公式可以计算得荧光量子产率14。2 结果与讨论结果与讨论2.1 实验条件的选择2.1.1 pH的选择通常，螺环结构的罗丹明衍生物不产生荧光，而

42、开环后能产生较强的荧光。实验采用乙醇-水溶液为介质，进行了酸度滴定实验（图 2） 。2345678902004006008001000pHFluorescence Intensity 1+Fe3+ 1+Cu2+ 1234567890.00.20.40.60.81.01.2AbsorbancepH 1+Fe3+ 1+Cu2+ 1 (a) (b)图 2(a)不同酸度下探针 1 (10 M)、Fe2+探针配合物、Cu2+探针配合物的荧光强度变化曲线。(b)不同酸度下探针 1 (10 M)、Fe2+探针配合物、Cu2+探针配合物的吸收强度变化曲线。结果表明，pH 6.5 的条件下 Fe2+探针配合物无

43、明显的荧光；pH 对 Fe2+探针配合物的紫外吸收无明显的影响。pH 6.5 时，Cu2+探针配合物的荧光强度减小但效果不明显，然而体系的紫外吸收明显降低。因此为了研究的一致性，本实验采用 Tris-HCl 缓冲溶液控制体系的 pH=6.5。2.1.2 溶剂比的选择实验结果表明，在一定的条件下，体系的荧光强度随着体系的含水量的增加而增强，当体系的含水量在 60%80%时，Fe2+探针配合物的体系荧光最强。为了将这一探针用于生物研究，本实验选择乙醇-水溶液为 1/4(v/v)的体系进行研究。010020030040050060010%20%30%40%50%60%70%80%Fluorescen

44、ce IntensityH2O%90%图 3 Fe2+（200 M）存在下探针 1 (10 M)在 Tris-HCl 缓冲体系(pH=6.5)的不同溶剂体系中的荧光强度的变化(557nm)。2.2 离子识别性能在 pH 5.010.0 的乙醇-水溶液 (1:4，V:V)介质中，探针在可见光区无吸收，在 557 nm 激发波长下不产生明显的荧光发射。实验选择 Tris-HCl 缓冲溶液控制体系 pH 为 6.5 左右，在该条件下，Fe3+的加入使探针溶液的荧光显著增强。Cu2+的加入可引起体系荧光强度的较弱变化，其它金属离子加入后体系基本无变化。而在一定的光照条件下，Cu2+的加入能使体系紫外吸

45、收强度变化显著，体系由无色变为紫红色。除 Fe3+的加入可引起体系的较弱变化外，其它的实验金属离子 Na+，Mg2+，Ca2+ ，Mn2+ ，Co2+，Zn2+，Sr2+，Cd2+，Hg2+，Ni2+对探针均无明显的响应信号（图 4） 。且随着 Fe3+及 Cu2+浓度的增大，体系的荧光强度和可见吸收强度也逐渐增强。这一特殊的实验现象表明，利用荧光或可见光谱可实现探针 1 对 Fe3+及 Cu2+的分别检测。体现了这一结构的探针对金属离子优越的选择性识别响应性能。4505005506006507000100200300400500600700other metal ionsCu2+Fe3+Fl

46、uorescence IntensityWavelength(nm)4505005506000.00.20.40.60.81.0other metal ionsFe3+Cu2+Wavelength(nm)Absorbance图 4 (a) 探针探针 1 (1.0010-5mol L-1)与不同金属离子(20 倍)相互作用的荧光光谱。(b)光照 3h 后，探针 1 (2.0010-5mol L-1) 与不同金属离子相互作用的紫外吸收光谱。(乙醇-水溶液，1/4, v/v, Tris-HCl pH =6.5)Fe3+对探针的荧光滴定曲线如图5，摩尔比法和Job法均推测出Fe3+与探针的作用比为1:

47、1。用该作用比计算得Fe3+配合物的稳定常数为1.50105。以罗丹明B(，0.89，乙醇溶液)为标准测定了配合物的荧光量子产率（）为0.75 14，表明配合具有较高的荧光量子产率。Cu2+对探针的吸收滴定曲线如图6，摩尔比法和Job法均推测出Cu2+与探针的作用比为1:2。用该作用比计算得Cu2+配合物的稳定常数为5.9104。40045050055060065070001002003004005000.00.20.40.60.81.00501001502001/1+Fe3+F-Fo 0.00.51.01.52.00100200300400500Fluorescence IntensityF

48、e3+/10eq2.0eqFluorescence IntensityWavelength(nm)4505005506000.00.51.01.52.02.50.00.20.40.60.81.00.00.51.01.52.02.51/1+Cu2+A-Ao0.00.51.01.52.00.00.51.01.52.02.53.0AbsorbanceCu2+/1(b)0eq2.0eqWavelength(nm)Absorbance图5 图62.3 共存离子的干扰实验研究了常见金属离子的共存对 Fe3+探针配合物的荧光强度的干扰（图 7） ，结果表明在相同实验条件下，探针除对 Cu2+有微弱响应外，对

49、K+，Na+，Mg2+，Ca2+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+,Zn2+，Sr2+，Cd2+，Hg2+，Ba2+,Pb2+几乎没有明显的响应，而加入 Fe3+能够诱导探针产生强而稳定的荧光发射及紫外吸收；在 Fe3+探针溶液中加入相对于 Fe3+浓度 2 倍的上述金属离子时，对配合物的荧光发射及紫外吸收强度的影响的相对标准偏差在 5%以内，即探针对 Fe3+的识别几乎不受这些通常共存离子的影响，具有较高的选择性。0100200300400500600 1+metal ion 1+metal ion +Fe3+Pb2+Ba2+Hg2+Cd2+Sr2+Zn2+Cu2+Ni2+Co2+Mn

50、2+Mn2+Ca2+Mg2+Na2+K+Fe3+Fluorescence Intensity图 7 探针 1 (1.0010-5mol L-1)与 Fe3+（2.0010-4mol L-1）的溶液中加入不同金属离子(2.0010-4mol L-1)后荧光强度的变化(乙醇-水溶液，1/4, v/v, Tris-HCl pH =6.5)，激发波长 557nm。 而 Cu2探针+配合物的吸收强度受 Fe3+的影响较大，Na+，Co2+，Zn2+对体系的吸收强度也有微弱影响（图 8） 。它们的存在可引起体系吸收强度不同程度的减少，溶液中其它共存离子几乎不对体系的吸收强度造成干扰。 0.00.20.40

51、.60.81.0 1+metal ion 1+metal ion +Cu2+Pb2+Ba2+Hg2+Cd2+Sr2+Zn2+Fe3+Ni2+Co2+Mn2+Ca2+Mg2+Na2+K+Cu2+Absorbance 图 8探针 1 (1.0010-5mol L-1)与 Cu2+（2.0010-4mol L-1）的溶液中加入不同金属离子(2.0010-4mol L-1)后紫外吸收强度的变化 (乙醇-水溶液，1/4, v/v, Tris-HCl pH =6.5)，amx=557nm。2.4 分析性能测定在 Tris-HCl 缓冲体系(pH=6.5)的乙醇-水 (1/4,v/v) 溶液中，以激发和发射

52、波长为 557/577nm，室温下测定 Fe3+对探针 s1 (1.0010-5mol L-1)的荧光增强的校准曲线，Fe3+浓度在 2.510-7 mol/L 2.510-5 mol/L范围内，体系荧光强度与浓度呈线性相关，相关系数 R=0.9952（n=8） ，检出限 7.4010-9 mol/L。以 557nm为最大吸收波长，测定体系吸光度与 Cu2+浓度的线性范围为 2.510-7 mol/L 2.510-5 mol/L，相关系数 R=0.9971（n=13） ，检出限 9.4910-8 mol/L。0.00.51.01.52.02.50100200300400500Fluoresce

53、nce IntensityFe3+10-50.00.51.01.52.02.50.00.51.01.52.02.5AbsorbanceCu2+10-5图 9 图 10图 9 探针 1 (10 M)与 Fe3+作用的 IfFe3+曲线(乙醇-水溶液，v/v=1/4，Tris-HCl，pH=6.5)，ex/em=557/577nm。 图 10 探针 1 (10 M)与 Cu2+作用的 ACu2+曲线(乙醇-水溶液，v/v=1/4，Tris-HCl，pH=6.5)，（amx =557nm）。2.5 探针配合物性质用HPLC方法对探针及配合物进行了分析，结果如图11所示。在保留值为11 min出现探针

54、色谱峰。当在探针中加入Fe3+后，11 min处的峰基本不见，而在6.2 min处出现了一个新的色谱峰，表明有Fe3+探针配合物生成。当探针中加入Cu2+，17.5min处出现一个新的色谱峰，而11 min处的峰基本不见，表明有Cu2+探针配合物生成。图 11以EDTA为配合竞争试剂，在Fe3+-罗丹明席夫碱配合物溶液中加入相对于罗丹明席夫碱80倍的EDTA，发现溶液立即褪色，荧光猝灭；当再加入100倍的Fe3+(相对于罗丹明席夫碱)后，溶液颜色、荧光及吸收强度均恢复接近未加竞争试剂前，此过程证明了配合反应的可逆性。从罗丹明席夫碱与金属形成的配合物特征红外吸收峰变化、核磁化学位移并结合光谱滴定

55、实验结果，推测配合作用的机理如图 12 所示。由于配合物的形成，诱导探针的螺环结构打开，发生荧光及吸收显著变化，这与文献报道的罗丹明类探针响应金属离子的离子诱导作用相同15,16,17。OEt2NNEt2NOCH3CH3ONOEt2NNEt2NOCH3CH3ON= Fe3+/Cu2+图 122.6配合物与牛血清蛋白的相互作用 研究蛋白质与配体之间的相互作用及动力学过程，对解释蛋白质结构与功能的关系及蛋白质与各种配体的作用机制意义重大。利用小分子配体与生物大分子结合前后的光谱差异，在不分离的情况下用分子光谱研究配体与蛋白质分子的相互作用。分别以罗丹明席夫碱及Fe3+-罗丹明席夫碱配合物为探针，研

56、究了与牛血清蛋白(BSA) 作用的荧光光谱特征。发现单纯的配体与BSA作用的光谱强度变化灵敏度远远小于配合物的作用，初步建立了利用金属配合物作为探针研究测定痕量蛋白质的方法。4505005506006507000100200300400500600700Fluorescence IntensityWavelength(nm)-5.0 -4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6-1.6-1.4-1.2-1.0-0.8-0.6-0.4lg( F0 - F)/FlgFe3+ 图 13 图 14图 13 C derivative 1 : 1.0 10-5 molL-1, CF

57、e3+ : 1.0 10-4 molL-1, pH 6.5, ex 557 nm.在室温下配合物能迅速与蛋白质结合形成复合物，并可稳定5h，其荧光强度基本保持不变。在一定的BSA浓度范围内，随BSA浓度的增大，Fe3+-罗丹明席夫碱配合物的荧光强度逐渐降低，并具有良好的线性关系（图14）。随着温度的升高，猝灭曲线斜率降低，初步证明该过程为静态猝灭。其荧光强度变化用静态猝灭公式18求得不同温度下的KA和n，结果见表2。数据显示，Fe3+-罗丹明席夫碱配合物与BSA的结合常数较大，且温度对结合常数KA影响很小。较大的KA数值说明Fe3+-罗丹明席夫碱配合物与BSA之间有较强的结合作用，可以被蛋白质

58、运输和储存。有机小分子和蛋白质之间的作用力主要有疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等。不同分子与蛋白质结合力的类型不同。由表2中数据：H 0，说明配合物与BSA 之间的主要作用力为静电引力，且G 0，所以配合物与BSA之间的结合反应是自发进行的，可以作为研究BSA的标记试剂。Table 2 The binding constants (KA), binding numbers (n) and correlation coefficients (R) between Fe3+ complex and BSAt/KAnRH/(kJ mol-1)G/(kJ mol-1)S/(JK-1 mol-1)nR3 3结论结论利用缩合反应一步合成得到了罗丹明酰肼缩苯甲酰丙酮，利用核磁和质谱对目标产物进行了表征。光谱研究表明化合物具有荧光探针性质，能选择性的响应Fe3+的荧光和Cu2+的紫外吸收。色谱及光谱分析均表明了Fe3+探针配合