钙离子对细菌内毒素含量测定的影响.docx

1、钙离子对细菌内毒素含量测定的影响魏振洲仃杜送田宙石超府王启珍k曹鑫祥马明霞兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗一室甘肃省疫苗工程技术研究中心W甘肃兰州730046摘要：目的研究Ca”对细菌内毒素含量检测的影响A探讨其影响机制N方法向已知含量的细菌内毒素溶液中加入不同浓度的Ca"。用动态浊度法检测各样品中细菌内毒素含量H对检测结果进行离散系数#即CV值分析确定干扰限值！对加入不同浓度C的细菌内毒素进行核磁共振'H谱研究J结果当C广浓度高于0J020molL时i检测结果的CV值较高j3+浓度越高"V值越高离散程度越大J当C浓度达到1mo.L时i检测结果低于检测限*呈现明显

2、的假阴性F1H谱研究发现F随着Ca"浓度的增高R处于低场的氢的化学位移向高场移动ilCa"浓度越高;移动越大；结论为获得准确的检测结果I当CF浓度高于0.0020molL时f应先消除干扰f再测定细菌内毒素含量KCa2+可能通过影响细菌内毒素的空间构象来影响其与堂试剂的反应If关键词:细菌内毒素P蜜试剂检测法/动态浊度法J钙离子1核磁共振i谱中图分类号：R927文献标志码：A文章编号：】0。55673(?(119)06-0(14厂05DOI:10.m09/ki.pmi.2019.06.007Effectofcalciumionindeterminationofbacteria

3、lendotoxinWEIZhen-ihou(DUSon'tiiniSHIChao(WaNGQiLheniCAOXiniMAMingiiaTheFirstBacterialVaccineDivisionlheD:agnosticSuppliesDiviiionfLanzhouInstituteofBiologi(alProductsCo.iLtd.iCenterforGan$uProvincialVaccineEngineeringResearchLanzhou7300461GansuProvince-ChinaCorrespondingauthor：MAM:ng-x:a-E_mail

4、：mamxl2Abstract:ObjectiveToanalyzetheeffectiromCa"indetectionolbacterialendomincontentandIoinvesligitelherelatedinllueDcialmechiDism.MethodsDifferentconcenlralionsofCt!*wereaddedIosknownconcentralioDolbacierialendotoxinsolutioniandthenlhebtcierialendotoxincontenlwndeterminedineachsampleaccordin

5、gtothedynamicturbidimelryiandanalysisofadiscretecoefficient(CV)wasperformedindeterminingoftheinterferencelimit.Thebacleriilendotoxinindbacleriilendoloxinsampleswithdifferen:concentrationsofCa:*werecarriedouibyusingolNMR1Hspectrumfsoastomakecerltinthepossibleinlluenciilmechanism.ResultsWhenlheCr+conc

6、entrilionwashigherthan0.0020mol/LfappearedaCi!4coneenlrationdependentpitlern(lheCVvalueiromlhetedresultwasincreased!wilbigreaierdegreeofdispersion.WhenlheCa?"concenlralionreached1mol/lhedelect:onresultwaslowerthmthede:eclionlimilfshowing8signilicantfalsenegative.ItwasfoundbjNMRHspectrumfastheco

7、ncentrrionofCb3+increased!thechemical$hiltfromhydrogenin:helowfieldmovedtowardthehighfield3ni3greatermovemenl&longw:ihahighCi:+coDcenlralioD.ConclusionInordertooblainlheaccuratedelectionreiultsiwhentheCrTconcenlritionwashigherIhm0.0020molILilheinterferenceshouldbeeliminatedfirstiand:henthebacter

8、ialendotoxinconlenlcouldbecorrectlydeiermined.TheCa1*mayinierferew:lh'ntersclionbetweenbacterialendotoxinandLAL(limulusamoebocyielyute)bymeansofaflecling:he$palia)con:o:malionofbacteria,endotoiin.Keywords:BacierialendotoiinlLimulusamoebocylelysate(LAL)teillDynamicturbidimetrymethod!CiltiumionjNM

9、R!Hspectrum细菌内毒素(endoioxin)是革兰阴性菌细胞壁上的特有结构'能导致人体发热、休克甚至死亡'勺作者简介：魏振洲(1打Di男i医学生物学工程师主要从事细菌性疫苗的检定工作H通信作者：马明馥#医学生物学工程师iE_mB：l:mjmrl2其化学成分主要是由特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成成类脂A是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团3M大肠杆菌主要基团结构见图14I细菌内毒素的检测方法主要包括：家兔检测法、图1大肠杆菌脂质A的化学结构4Fig.lThechemicalstructureoflipidAfromEscherichiacoliGC/MS检测法

10、及鲨试剂检测法等富内毒素能与蜜试剂发生特异性的反应而被检测K分为凝胶法、浊度法和比色法#'对于曾血变形细胞裂解液凝集反应机制的研究直到20世纪70年代后期G才由日本学者阐明N堂血变形细胞裂解液中有许多能被内毒素激活的凝固系统R主要有凝固酶原、C因子、B因子及凝固蛋白原等计内毒素激活C因子*活化的C因子又激活B因子i或由（3）TD一葡聚糖激活G因子（G因子系统）«接着激活的B因子或激活的G因子。再去激活凝固酶原使其转化为活化的凝固酶原W该酶切断凝固蛋白原中特定的精氨酸肽链府形成凝固蛋白S产生凝胶仲除此之外就凝固酶还对蜜三肽有酰氨酶活性N使硝基苯胺游离&而发生成色反应5f

11、近年来府很多科研工作者研究了蜜试剂检测法的干扰因素58R本文探究了钙离子对细菌内毒素含量检测的干扰*现将结果报道如下甘1材料与方法1.1样品含不同浓度Ca2+的细菌内毒素标准品溶液（批号20190501'20190511）i由兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗一室提供用1.2主要试剂及仪器蜜试剂（检测范围0.03、10.00EU/mL）、细菌内毒素检查用水（内毒素含量<0.003EU/mL）均购自湛江安度斯生物有限公司i细菌内毒素国家标准品由中国食品药品检低研允院提供9氯化钙购自国药集团化学试剂有限公司0二甲基亚砺1（Dimethyllulfoxide）购自Alia公司IBET7

12、2M细菌内毒素测定仪购自天津天大天发仪器设备有限公司jVORTEX_GENE2漩涡混合器购自美国SI公司jBruker（300MH?）核磁共振仪购自美国Bruker公司H'1.3细菌内毒素检测1.3.1待测样品的制备向己知含量的细菌内毒素标准品溶液中加入不同浓度的Ca2+以验证Ca2+对细菌内毒素含量检测的影响J称取适量CaCh于玻璃瓶中R250°C干烤1h干燥器中放至室温月细菌内毒素检查用水溶解CaClJ并依次梯度稀释:'得到浓度分别为2.0000.1.0000>0.5000.0.2500.0.125 0.0.0625.0.0313.0.0156.0.0078

13、.0.00390.0020mol/L的CaCl,溶液j将效价为8。EU支的细菌内毒素国家标准稀释K得细菌内毒素浓度为0.5000EU/mL的溶液J最后1分别取浓度为2.0000.1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078、0.0039.0.0020mol/L的Ca"溶液0.5mL于试管中if向各管中加入0.5mL浓度均为0.5000EU/mL的细菌内毒素溶液Ca2+浓度分别为1.00。0、0.5000、0.250D、0.1250、0.D625、D.D313、0.Q156.0.0078.0.0039、0J020,0.0

14、01Dmol/Lf细菌内毒素浓度均为0.2500EU/mL的样品H3.2动态浊度法检测细菌内毒素含量细菌内毒素标准曲线的制备#在超净工作台下,取效价为80EU/支的细菌内毒素国家标准品1支彳用细菌内毒素检查用水溶解i涡旋混合器混匀15mini稀释0.5000.0.2500.0.1250.0.0625.0.0313EU/mL5个浓度月取3支蜜试剂分别加入细菌内毒素检查用水静宣充分溶解后混合待用月取内毒素测定仪专用试管14支ft分别加入0.1mL鲨:试剂®每个点取2个平行管H其中1管加入内毒素检查用水作为阴性对照有4管加入内毒素标准品作为阳性对照3"14管加入稀释成0.500。

15、、0.250。、0.125R0.025、0.0313EU/mL5个浓度的内毒素标准品W样品细菌内毒素的检测是将样品稀释成无干扰的浓度N立即放入反应器中开始检测甘待最后一个浓度点的反应曲线超过限值后彳停止检测W计算数据彳得出样品细菌内毒素含量S1.4核磁共振法测定钙离子对细菌内毒素含量检测的影响1.4.1NMR样品的准备将细菌内毒素标准品溶解在DMSOi分别加入CaCIJ使得Ca-浓度分别约等于细菌内毒素麻准品浓度的0.0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0割1.4.2谱的测定由核磁共振仪来完成细菌内毒素标准品的谱R通过含不同浓度Ca2+的样品1H谱变化来推测Ca2f对细菌内毒素含量检测的影

16、响机理N】H谱数据表示如下:化学位移R积分彳多样性(br为宽峰Rs为单峰Rd为双峰ilt为三重峰。q为四重峰im为多重峰)j耦合常数以HeJ0z(HO表示j1.5统计学分析用IBMSPSSSlatisiics22.0软件对数据进行统计学分析R计算出含不同浓度Ca2+的样品的检测结果的离散系数R即CV值孑CV值等于标准差与平均值之比彳CV值越大则离散程度越大«CV值越小则离散程度越小：当CV值<10%时认为离散程度较小i检测结果受干扰因素影响较小R结果可接受*2结果2.1动态浊度法检测细菌内毒素含量结果显示BCa"的加入对细菌内毒素含量的检测有影响蜀Ca2+的浓度越高，

17、影响越大1当C产浓度为1molL时f样品中细菌内毒素低于检测限K见表1S对检测结果进行CV值分析#当Ca2+浓度高于0.0020mo：L时检测结果CV值较高iCa"浓度越高CV值越高R离散程度越大H见表2K表1加入Ca2+的细菌内毒素溶液的检删结果Tab.lDelerm.nitionofbtclerialendoloxinsolutionsaddedwi:hCa:*样品批号样品中Cai及细菌内毒素理论含量CL浓度(mol/L)内毒素浓度(EUmL)实测细菌内毒素(EU/mL)201905011.000201905020.500201905030.250201905040.125201

18、905050.062201905060.031201905070.015201905080.007201905090.003201905100.002201905110.0010.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.2500检测限0.01300.03260.04970.06110.09680.11420.14680.18330.22360.2663表2细菌内毒素含量的CV值Tab.2Coefficientofvariation(CV)forbacteridendotoxincon:en:Cam理论浓度(mol,

19、L)实测细菌内毒素(EU/mL)1.0000检测限0.50000.01300J1300.25000.03260.03260.0326'0.12500.04970.04970.04970.0497一0.06250.06110.06110.06110.06110.0611_0.03130.09680.09680.09680.09680.09680.09680.01560.11420.11420.11420.11420.11420.11420.1142一0.00780.14680.14680.14680.14680.14680.14680.14680.1468'0.00390.183

20、30.18330.18330.18330.18330.18330.18330.18330.18330.00200.22360.22360.22360.22360.22360.22360.22360.22360,22360.22360.00100.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26631CV(%)/68.70。059.82。052.11DD44.810036.350030.30。022.870。15."。D$.7400注：-无此项j/.未计算41. 2核磁共振法测定钙离子对细菌内毒素含量检测的影响细菌内莓素样

21、品进行'555进伸忻5伽MHiDMSO)It.iT(HJ=t.SBti1H<6.33<Hj=itHH1皿5.41(s<2H)li4.98(dBJ=4.7Hz#1H)B4.89(s1H)i4.78(sit2H)i|4.32(tilJ=7.1Hzt1H)t4.18(si2H)it3.71(mi3H)i|3.62($<5H)if3.5广3.41(m(16H)i3,33(mi'55H)i3.17(m(1H)if2.95(mH1H)K见图2H随着Ca2+浓度的增高R处于低场的氢的化学位移向高场移动SCa2+浓度越高N移动越大开除了化学位移有所变动/氢的信号强度基本

22、相似W见图3用因此«Ca2+的存在可能会影响细菌内毒素的空间构象Wooz.f8*£0二S9-寸98好90空寸-or寸芯打6*RS寸新S寸009寸6一9寸6号寸W.寸£.寸UV46Z096Hppm5.55.()4*54.03.53*02*52.01.5LO().5目照丽咽wm注:每个峰表示的是被检测物品的氢的化学位移j积分面积表示氢的个数Pppm是化学位移的单位,图2细菌内毒素的z琳Fig.2AnilysisofbacterialendoloxinbyNMR'IIspectrum注：H谱广6的Cl-浓度分别为细菌内毒素标准品浓度的日、0.5,1.0,2.0,

23、3.0.-1.0倍量jppm是化学位移的单位f图3加入不同浓度Ca2+的细萌内毒素的ifFig.3AnalyjisofbacteridendotoxinsddedwithdilferentconcentrationsoiCr*byNMRHspeciium3讨论细菌内毒素蜜试剂检查法由于检测灵敏度高、检测范围宽、结果准确、应用面广R从而被多个国家收录于药典中N研究表明麻试验环境、样品纯度等均有可能造成不准确的检测结果#为验证Ca"对细菌内毒素含量检测的影响n向浓度为0.2500EU/mL的细菌内毒素溶液中加入不同浓度的Ca2+再用动态浊度法检测各样品中细菌内毒素含量i结果显示i当C姑浓

24、度高于0.0020mol/L时i检测结果的CV值较高nCa2+浓度越高nCV值越高N离散程度越大j当C广浓度高于1mWL时1检测结果低于检测限呈现明显的假阴性用对细菌内毒素以及加入不同浓度Ca2+的细菌内毒素，容液进彳亍'11谖"究发现'Mi«c/.浓度的增高处场的级的化向尚场秒动fC浓度越部移动越大，而翅的信*J魅度和枳分面枳均未发现明显改如因此？Ca'-可能是通过彩乾细苗内猝素的空间构象来影响其与盆试剂的反应N空向构段百变的缅南内毒素不陲激活C因子，未活化的C因了无法激活B因子？m冏舶脱无法被激活，从而无法切断故团步白晚中将定的福敏酸肽做#不fi

25、S形成凝固安门及产生凝段&细诵内寄紊的检刈出现假明性站果$Ca"浓度越高£tfl萌内咨素的空间构象改变建大。越不易与贫试剂发生反应，见图if双链C因子细菌内存素活化的C因子单链C因子线路I精氨酸肽链凝固蛋白图4Fig.2TheB因子活化的B因子活化的凝固酶原凝固福原活化的G因子G因子线路2(1-3)QD-葡聚糖细菌内毒素与鲨试剂反应机制5mechaniimonreactionof1)scierialendotoxinandLALreagent综上所述N鲨试剂检测法对细菌内毒素含量进行测定时K测定结果会受一定浓度的Ca2+干扰甘当Ca”浓度高于1mol/L时d检测结果呈现假阴性iCa2+浓度越高旧干扰程度越大#通过核磁共振"谴奴iC/可能地通过影响细苗内毒素的空向构纹来影响其与fit试剂的反应f从而影响检测姑果的准确性因此：夜用at试剂法进行细曲内洋紊含斌测定时？应先酒除c，''的干扰1参考文献1 许剑平i何晓凡熊石龙i等.血小板对单核细胞促凝活性的影响.中华血液学杂志i2001(22(9):478_479.2 HAR