长链CpG寡脱氧核苷酸DNA重组质粒对禽流感灭活疫苗免疫应答的影响.docx

1、长链CpG寡脱氧核昔酸DNA重组质粒对禽流感灭活疫苗免疫应答的影响*司兴奎，陈建红，张济培（佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山528231）摘要：为明确导入长链CpG寡脱帝核替酸3个DNA重组质粒对禽流感H5亚型灭活疫苗的免疫应答的影响，将21日龄试脸雏鸡随机分为6组，即健康对照组（A组）、疫苗对照组（B组）、空载体对照组（C组）、pUC26免疫促进组（D组）、pUC3（）免疫促进组（E组）及pUC44免疫促进组（F组），对6组雏鸡在首免后18周（WPI）检测其HI抗体水平并在1、4及8WPI测定脾脏、法氏黄及胸腺免疫器官指教。研究结果表明：在2WPI,D（PvO.（）1）、F（PvO.（）

2、1）及E组（Pv（）.05）HI抗体水平极显著或显著高于C组；在3WPI.F组HI抗体水平分别显著高于B（PVO.O5）、C（PVO.O5）及£组（PV0.05）；在5WPI,F（PvO.（）l）和】）（Pv（）.O5）组HI抗体水平极显著或显著高于C组；在6WP1.F组HI抗体水平显著高于C组（PV0.05）；在8WPI,F组HI抗体水平极显著高于B（P<0.01）或（2组（P<0.（）l）o在4WPI,A组胸腺指数极显著或显著高于C（P<0.05）及。组（Pv（）.（）l）,E组胸腺指数显著高于。组（PV0.05）；在8WPI,E组脾脏指数显著高于人组（PV0.

3、05）。关键词：CpG寡脱敏核昔酸DNA重组质粒;禽流感灭活疫苗；免疫应答;免疫器官指数EffectsofRecombinantPlasmidsContainingLongStrandCpGOligodeoxynucleotidesDNAonImmuneResponsesofInactivatedAvianInfluenzaVaccine,SIXingkui,CHENJianhong,ZHANGJipei(DepartmentofAnimalMedicine,FoshanScienceandfechnologyUniversityJ'oshan,Guangdong528231)Abst

4、ract：ToclarifytheimmunologicalenhancementeffectsofthreerecombinantplasmidscontainlongstrandCpGoIigodeoxynucleotidesDNAtorecombinantavianinfluenzavaccine(H5N1,Re-1),21-day-agechickenwererandomlydividedinto6groupsi.eA(healthycontrol).B(vaccinecontrol)C(vacantvectoran<lvaccinecontrol),D(pUC26enhance

5、mentgroup),E(pU(30enhancementgroup)andF(pUC44enhancementgroup).TheserasamplesofeachgroupwerecollectedatIto8weekspostthefirstinjinunizatinn(WPI).andspleen,bueaandthymusindexeswereobtainedat1,4and8WPI.TheresultsshowedthatHIantibodytitersofgroupD(P<0.01),F(P<0.01)andE(P<0.05)weresignificantlyh

6、igherthanthoseofgroupCat2WPI；andHIantibodylitersofgroupFwerestatisticallyhigherthanthoseofgroupB(P<0.()5),C(P<0.05)andE(P<0.05)at3WPI.respectively;andHlantibodylitersofgroupF(P<0.01)收隔日K：2009-04-29修回日那：2009T）6-09基金项目：广东省科技攻关项H资助（2004A2090103）andD(P<0.05)weresignificantlyhigherthanthos

7、eofgroupCat5WPI；andHIantibodytitersofgroupFwerestatisticallyhigherthanthoseofgroupC(P<0.05)at6WPI；andHIantibodytitersofgroupFwerestatisticallyhigherthanthoseofgroupB(P<0.01)andgroupC(P<0.01)at8WPI.Forthymusindexes,groupAweresignificantlyhigherthanroupC(P<0.05)andgroupD(P<0.01)at4WPI,g

8、roupEwerestatisticallyhigherthangroupD(P<0.05)at4WPI,groupEwerestatisticallyhigherthangroupA(P<0.()5)at8WPI.Keywords：CpGODNDNArecombinantplasmids:inactivatedavianinfluenzavaccine；immuneresponse；immuneorganindex在70年前,Feund,J发现死亡的分枝杆菌对易感动物具有不依赖抗原的免疫刺激活性，随后的研究证实弗氏佐剂的这种免疫激活作用与特定的短链细曲DNA序列部分相关，该短链细

9、菌DNA序列可提高接受基因免疫的动物的Thl型反应。进一步的研究结果证实，分枝杆菌DNA中的CpG基序为其具有免疫剌激活性的主要原因。除细菌中CpGDNA夕卜，人工合成的含有CpG基序的脱氧寡核甘酸（oligodeoxynucleotides,ODN）也可激活机体的免疫反应。因此，近年来CpGODN成为医学和动物医学领域的研究热点，并显示出较广阔的应用前景。本研究对已成功构建的导入K链CpG寡脱氧核样酸的3个DNA重组质粒对禽流感H5亚型灭活疫苗的免疫应答的影响进行研究，以期筛选出具有免疫激活作用的含K链CpG寡脱轼核甘酸DNA重组质粒。1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物144R21日龄

10、禽流感非免疫石岐杂雏鸡购自南海种鸡场。1.1.2重组质粒含11J3及10个ctagatcgtcgttttGTCGTTTTGTCGTTGAGGGGGGAT拷贝K链CpGODNDNA并克隆入pMD18-T载体的3个重组于pUC26、pUC3（）及pUC44由佛山科学技术学院禽病实验室构建国。1.1.3疫苗、检测标准抗原及阳性血清重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,ReT株）（2008014）为哈尔滨维科生物技术开发公司产品。禽流感H5亚型HI抗原（20080212）、禽流感H5H1血清（040522）均为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所产品。1.2方法1.2.1试验动物分组方法将144H21日龄禽

11、流感非免疫惟鸡分为6组,24只/组,即A、B、C、D、E及F组。各组情况见表1o表1试验雏鸡的分组及免疫情况组别210龄免疫方法42日龄免疫方法A注射生理盐水（）.5mL/只注射生理盐水I.OniL/只.作为健景对照钮B肌注禽流感技苗（L5mL/只肌注禽心疫苗C除向B外.机注溶于20%作陪溶液的pUCl««体（500jig/只）除同B外.肌注溶于20%赧稽溶液的pUC18fl体0.5mL/只(S00pig/只)0.5mL/只D除何B外,肌注溶F溶液的pUC26重31千（500乂"只）除呵B外.肌注溶于2<1%掠精溶液的pUC26索组子0.5n】L/只(50(

12、)pig/只)0.5mL/只E除同B外.凯注溶于211%城的溶液的pUC30重甄子（50OIHJ/FD除同B外，|11注涪于20%/糖溶液的pUC30子0.5mL/只(500)0.5ml./只F除同B外注溶f31%酝籍溶液的pUC44政蛆子（500a"只）除同B外，机注溶于20%蔗籍溶液的pUC440.5m【./只(500MR/只血5ml/只1.2.2血液样品采集方法各组在免疫前（随机采取13只）及免疫后1、2、3、4、5、6、7及8周（WPI）经颈静脉采集血液，分离血清.-20%：保存备检。1.2.3HI抗体水平检测方法采用微最血凝抑制试验（HI）方法进行，具体按照高致病性禽流感疫

13、情处置技术规范（试行）（2004）进行，相应抗体水平以（X±SD）表示，采用t检验对HI抗体水平进行统计学分析。1.2.4免疫器官指数的测定方法在1、4及8WPI各组随机称量5只锥鸡的单重（g）,经颈静脉放血处杀后，采集对应各组各只雏鸡的胸腺、脾脏、法氏囊称重（mg）,以每只雏鸡的各免疫器官重量（mg）与相应单重（g）相除即得相应免疫器官指数（以（又士SD）表示），采用t检验对各组免疫器官指数进行统计学分析。2结果与分析2.1各组HI抗体水平检测结果对各组免疫前及免疫后18WPI血清进行HI抗体水平检测，免疫前13只维鸡H5抗体水平均低于21og2,免疫后的抗体检测结果表明：A组在1

14、WPI为零，旦整个试验过程中雏鸡健康抗体始终为零,B、C、D、E及F组的HI抗体水平检测结果见表2及图1。如表2及图1可见，在2WPI,D（Pv0.01）、F（Pv0.01）及E组（Pv（）.05）HI抗体水平极显著或显著高于C组;在3WPI,F组HI抗体水平分别显著高于B（PvO.O5）、C（PvO.O5）及E组（PvO.05）；在5WPI,F（Pv0.01）和D（P<0.05）组HI抗体水平极显著或显著高于C组；在6WPI,F组HI抗体水平显著高于C组（氏0.05）;在8WPI,F组HI抗体水平极显著商于B（PV0.01）和C组（PV0.01）。综上，在重组禽流感病毒灭活疫苗的5组中

15、,HI抗体水平最高的为F组（pUC44组）,D组次之（PUC26组），随后为B组（疫苗对照组）、E组（pUC30组），相对最差的为C组（载体对照组）。表2免疫后不同时间HI抗体水平检测结果1。宓江：差异星鲁（氏0.05）;*星异级基著（氏0.01）,下固，组别1WPI2WP13WPI4WPI5WP16WPI7WPI8WPIA00000000B0.410.74.0±2.35.8+I.67.4±1.39.6±0.59.7±0.89.0±0.97.9±1.7C0.3±0.72.6±1.55.3±2.16.8&#

16、177;1.49.0±0.88.9±|.08.9+1.17.5±1.5D05.1±1.2-6.3+1.67.3±0.79.8±0.5*9.6+0.59.3±1.58.512.0E0.1+0.45.0+2.6,4.8±2.67.8±1.69.0*1.48.8M.38.8±1.87.812.1F0.41V.76.0±2.0"7.8±1.9,8.0±1.810.0±0"9.8±0.5*9.3+1.09.8±0.5-图1免疫

17、后不同时间HI抗体的消长曲线图1免疫后不同时间HI抗体的消长曲线(警一)*一h2.2各组免疫器官指数的测定结果在1、4及8WPI对各组随机抽取的5只雏鸡测定相应的脾脏、法氏囊及胸腺的免疫器官指数，结果见表3O由表3可见，在4WPI,A组胸腺指数极显著或显著高于C（P<0.05）及D组（PV0.01）,E组胸腺指数显著高于D组（PV0.05）；在8WPI,E组脾脏指数显著高于A组（PV0.05）。就脾脏、法氏囊及胸腺免疫器官指数总体来看（除4WPI时,A组胸腺指数高于E组外），在4及8WPIE组较其他5组的免疫器官重量略高，提示其免疫系统生长发育略好于其他各组，但其HI抗体水平却低于F、D

18、及B组，结果不尽一致，造成这种情况的差异是由于不同CpGODNDNA诱导机体产生对疫苗的选择差异抑或是其他原因所造成，有待进一步研究。表3免疫后不同时间脾脏、法氏囊及胸腺的免疫器官指数类别免疫后周数ABCDEF脾脏指数11.85+0.742.0210.621.9310.631.6010311.64±0.492.07±0.6941.5310.301.79±0.292.17+0.651.64±0.561.6910.471.86±0.4()81.24+0.151.29±0.341.49±0.891.47±0.541.76

19、±0.46,1.64±0.56法氏囊指故14.27±1.994.37±0.553.77+0.793.87±1384.72U.793.0611.6843.45±1.502.88x1.043.37±0.363.63±0.983.58±1.242.66±0.7281.«6±0.762.09±1.251.94±0.781.95±1.012.19±0.781.55±0.66胸腺指数15.87±0.735.83+1.066.14

20、10.875.51±1.576.17±2.455.43+2.4247.4211.735.47+1.954.98±!.30,4.13±1.04-5.62±1.05,5.46±1.073讨论修饰后才能抵抗体内核酸酶的降解，从而延长其人工合成的CpGODN必须进行硫代磷酸化寿命和增强其免疫刺激作用。由此（下转第35页）等报道SOD活性在罗曼公雏感染柔嫩艾美耳球虫后的盲肠组织中显著降低，但在肝、脾、肾组织中显著升高。金光明等报道SOD活性在罗曼公维感染柔嫩艾美耳球虫后的心、肝、脾、肺组织中显著升高,但在肾组织中无变化。分析其产生的原因，一是鸡

21、的不同遗传背景，二是组织器官在抗疾病中的生理功能的差异，三是能活力的测定方法或操作误差,但笔者认为前二者是主要的原因。在研究不同品种地方鸡对柔嫩艾美耳球虫的敏感性时发现,4个品种鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，成活率、病变扣分、相对增敢率、卵囊值等方面存在着差异。其中固始鸡对柔嫩艾美耳球虫敏感性最高，表现为感染后的死亡率最高、病变扣分最多，抗球虫指数也最低；汕鸡对柔嫩艾美耳球虫的敏感性最低，表现为感染后的死亡率为零、病变扣分和血粪扣分最少，每鸡平均排卵囊数最少，抗球虫指数最高；大骨鸡和鹿苑鸡对柔嫩艾美耳球虫的敏感性相近，位于固始鸡与油鸡之间。这种敏感性上的差异与其感染球虫后组织抗氧化功能活性的变化有何

22、关系，就本试验结果而言不十分明晰，但比较T-SOD活性在大骨鸡、鹿苑鸡、油鸡和固始鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心脏和有肠组织中的变化，发现在油鸡体内有些特点,T-SOD活性在肓肠组织内持续下降。参考文献：1索勋，李国清.鸡球虫病学：M.北京：中国农业大学出版社，1998.149-151.2窦新红.不同品种鸡对柔撤艾美耳球虫的敏感性和组织抗皈化功能活性的比较研究D.扬州：扬州大学,2006,22-26.3李佩国，李鱼玉，张香斋.等.推鸡感染柔嫩艾美耳球虫后血消生化指标的动恣变化J).中国兽医学报，2008,28(6):676-679.4聂奎，李竟，肖昌.等球虫病及药物对锥鸡LPO含址和SOD、GSH-

23、Px活性水平的影响.四川畜牧兽医学院学报，20()1,15(2)：1-6.5杨保收，陈越，龚伟，等.钗自由基致损伤的分子生物学机制UL中国兽医杂志，1999,25(1)：41-45.6HarmanD.Freeradicaltheoryofaging:Alzheimer'sdiseasepathogenesisJ.Age,1995,18(3)：97119.7金光明，张岱芋，顾有方，等.柔嫩艾美耳球虫感染后组织抗机化功能的动态变化IJL中国兽医学报,2005,22(3):233-235.8郑明学.站克光，古少眄.等.惟鸡感染柔嫩艾美耳球虫后脂质过敏化物的变化JJ.中国兽医学报.2002,22(3):236-237.(上接第31页)就导致其成本很高，严重限制了在兽医临床生产中的应用。如果通过合成双链CpGDNA并克隆入载体构建成重组质粒后，即可获得大量的CpGDNA,成本大大降低。许洪林等首先构建分别导入9和16拷贝的CpGODN。体外试验表明，随着插入CpGODN拷贝数的增加，活化小鼠B细胞诱生IgM能力逐渐增强，而活化NK细胞诱生IFN-7能力依次降低。体内试验发现，16拷贝的CpGODN能明显提高IgGl亚型抗体水平，但所有质粒DNA均能显著提高特异性IgG2a亚