预防PRRSV的载体疫苗的研究进展.docx

1、预防PRRSV的载体疫苗的研究进展李国峰，韩鹤，翟宇(吉林省梅河口市动物疫病预防控制中心，梅河口135000)DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2014.03.005猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)是影响世界养猪业的一种传染病的病原体，该病毒对养猪业造成巨大的经济损失。然而商品化疫苗在预防该病毒感染方面效果却不显茗，PRRSV弱毒苗还存在散毒和返强的危险性，因此寻找-种新的有效的疫苗势在必行。目前,一种基于病毒载体的疫苗可以作为PRRSV活疫苗的一个替代品，本文对目前用来防

2、御PRRSV的载体疫苗包括伪狂犬病病宙,痕病毒，腺病毒作简介，并特别对作为PRRSV抗原表达载体的传染性胃肠炎病毒(TGEV)进行介绍，这种载体可表达较大的异源基因，同时也是潜在的IFN-a诱导剂.TGEV载体通过与诱导PRRSV中和抗体和细胞免疫反应的主要蛋白-GP5和M蛋白进行重蛆，并对重组蛋白进行保护性试验。结果表明该疫苗产生抗体水平更高，时间更快。并且对攻毒动物也有部分保护性，但其中和抗体表达水平较低。同时本文对改善PRRSV抗原rTGEV载体疫苗表达系统提出了几点建议。1影响PRRSV疫苗发展的因素影响疫苗发展的主要问题有3个：(1)保护机制不清楚，PKRSV的结构蛋白具有较大的抗原

3、变异性，因此可能会诱导免疫系统的负调节。虽难次级结构蛋白在PRRSV感染中也是必须的并且也可以产生保护性免疫，但是，通过对PRRSV结构蛋白的分析发现.CP5-M异源二聚体可能是诱导保护性体液免疫和细胞免疫的主要蛋白。另外，人们对诱导保护性T细胞反应的T细胞表位的认识也非常有限;(2)病毒抑制或逃避宿主免疫反应的-个机制是通过调节性T细胞来进行的，但是抑制性T细胞在PRKSV感染后延迟免疫反应的机制还不太清楚，且在这个过程中病毒蛋白也可能有所参与；(3)PRRSV病毒毒株的多样性,即使是同-个基因型，也有许多亚性，在所有结构蛋白中，M蛋白是最为保守的一个,GP5蛋白是变异性最大的一个蛋白，而这

4、种抗原的高变异性正是阻碍通用疫苗发展的一个大问题。因此.解决这个问题的关键是确定关键的B和T细胞表位，另外，不同遗传背景的猪产生的免疫反应不同也是一个重要的问题，因此，对PRRSV感染猪后宿主反应的了解也是发展有效疫苗要面临的问题。2载体疫苗如上所述，无论是PRRSV弱毒苗还是灭活苗都已被生产应用，弱毒苗在预防上优亍灭活苗。但也存在严重的问题，如不完全保护、持续性感染、和力返强等，并且这些问题也日渐严重。目前，基于载体的疫苗在剌激体液和细胞免疫反应上存在一个优势，目前病毒载体的效果至今并不令人满意，因此需要进-步对新的或抗原组合性载体进行探索。2.1伪狂犬病痛毒|7|汪玲.KAP7.1、KAP

5、8.2基因在辽宁新品系绒山羊兴盛期毛囊中表达及分析D|.大连:辽宁师范大学,2010.8张俊戏，等.KAP6基因家族成员在肝胎期山羊皮肤中的表达J.畜牧与饲料科学,2009,30(3):20-21.13|9姚玉园，等.IGF-1和EGF对辽宁绒山羊初级毛囊体外培芥的影响(J.沈阳农业大学学报,2010,41(2):165-169.10 BninoJBetal.Exprzdonofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)receptpringoatovariesandimprovementofinvitrocaprinepreanlndfolliclesurvi

6、valandgrowthwithVEGF|J.Reproduction.FertilityandDevelopment.2009.21(5):679-687.11 YanoK.BrownIF.DetmarM.ControlofhairgrowthandfolliclesizebyVEGF-mediatedangiogenesis.JClinInvrsl2001;107:409-417.12|胡秀芝，等.绒山羊毛囊的周期性发育及其分子调控研究进展J.家畜生态学报,2012,33(5):1413 FischerTW,etal.MelatoninandthehairfoUiclcJ)JPinealR

7、es.2008,44:1-15.14 CeliP,c(al.Relationshipsbetweenbloodhormonalconccntmtionsandsecondaryfibersheddinginyoungcashmere-lxtaringgoatattheirfibremoult(J,BritishSocietyofAnima)Science,2003.77:371-381.15 李箭，等二醇对体外培养城山羊初级毛囊的影响几安徽农业科学,2009.37(1):151-152.伪狂犬病病毒(PRV)为a-疱疹病毒，属于疱疹病毒家族，猪是PRV的自然宿主，病毒也可以感染许多其它脊椎动物

8、，为了根除该病毒，人们研制r改性活疫苗。所有的疫苗都是GE基因苗，即有一个GE基因缺失,GE基因的缺失可以减少病毒的传播,但那并不影响其在细胞培养中的产最同时也可以诱导保护性免疫反应，这些PRV弱毒苗现在d经用于-些疫苗的载体,如猪瘟，猪圆环病。另外,研究者们也构建了一种可以表达PRRSVGP5蛋白的PRV重组病毒，并通过接种4周龄仔猪进行保护性评价，通过使用PRRSVCH-1毒株进行攻毒试羚，在攻毒前包括商品化活疫苗对照组的所有猪都没有检测到GP5抗体，攻毒后在所有猪中都检测到了抗CP5蛋白抗体,没有一头猪产生抵抗PRRSV的中和性抗体。但与商品疫苗相比,PRV载体苗组的肺脏病变，病毒血症要

9、轻，并且组织清除病毒的速度较快。2.2财毒腺病毒是目前最广泛的基因传递系统，作为受体，它可以导入高通量的外源基因（从2KB到36KB）并能够在多种细胞中进行转导，多种复制缺陷性重组腺病毒现在已经用作PRRSV载体,用来研究疫苗或分析PRRSV免疫原性等。目前已经构建出一系列可以表达CP5.M和M-Gly-Thr-Thr-CP5融合蛋白的重组腺病毒,并通过小鼠模型对这些重组病毒中进行检测。结果表明M-GP5魅合蛋白重组腺病毒与GP5和M蛋白重蛆腺病毒及空白腺病毒载体相比可以产生更为明显的体液免疫中和抗体。同时M-GB5融合蛋白重组腺病毒也能够诱导淋巴细胞增殖和毒性T淋巴细胞反应。这些保护性评并未

10、在猪体内进行评价。23痘病毒是已知的最大的动物DNA病毒。它也被广泛的用于疫苗的表达载体。它可以表达较大的外源基因，并可诱导强烈的细胞介导的体液免疫应答。鸡痘病毒（FPV）是第一个用作PRRSV疫苗载体的痘病毒，它属于禽痘病毒属，并仅可在禽类体内进行复制。然而FPV弱毒株已经用于禽类和哺乳类动物载体，并可产生强大的保护性免疫反应。通过FPV载体构建了一个GP5-Pro-Pro-Ser-GP3融合蛋白重组病毒和一个GP5-Pm-Pro-Ser-GP3融合蛋白与猪118相结合的重组病毒，仔猪接种试验发现FPV重组蚩白在接种后42d可以表达PRRSV抗原诱导的中和抗体。免疫动物也可诱导1FN-7的增

11、加。仔猪接种共表达PRRSV抗原和IL-18的重组FPV可产生的IFN量比单独表达GP5-GP3融合蛋白的重组病毒要高。并且对同源毒悚感染也有部分保护。3猪传染性胃肠炎病毒作为载体与其它表达系统相比,冠状病毒作为载体有以下几个优点：（I）他们是单链RNA病毒,无DNA形式,因此病毒基因不会整合到宿主基因组中；（2）这些病毒的基因组较大，原则上为大的外源基因的插入提供空间；（3）是肠相关淋巴组织分泌性免疫反应最佳的剌激诱导物。由于冠状病毒一般可以感染呼吸道和肠道粘膜的表面，因此，这些病毒可用于针对肠道和呼吸道的抗原产生较强的分泌性免疫反应;（4）冠状病毒的趋向性可以通过对S基因的修改进行设计;（

12、5）非致病性冠状病毒可以感染大多数物种（人，猪，牛，犬，猫，和禽）因此比较适合开发安全的病毒载体;（6）传染性冠状病毒的cDNA克隆也可用来对表达系统进行设计。猪呼吸冠状病卷（PRCV）是猪传染性胃肠炎病毒的突变体，它可以在呼吸道中复制，并无或仅导致轻微的临床症状。因PRCV已在全球范围内堂延，并旦诱导的抗体也可以中和猪传染性胃肠炎病毒，因此，体内预存的免疫性抗体对TGEV载体的抵抗可能是影响其发展的一个问题，然而，体内实验表明：共至在rTGEV载体二次感染猪后，其抗TGEV抗体已经开始升高。重组TGEV（rTGEV）作为PRRSV载体的一个主要的优点是TGEV是IFN-a的一种强诱导剂。另外

13、，如上所述,TGEV可能会出现在粘膜部位，从而诱导粘膜免疫和全身免疫反应。因此rTGEV载体将会成为研究诱导抗PRRSV保护提供一个新的策略。3.1表达PRRSV扰原的TGEV成体3.1.GP5-M抗原平台PRRSV结构蛋白GP5和M在感染细胞的内质网发生聚集.在那里它们通过二硫键形成异源二聚体，促进病毒粒子的进入。在感染细胞中也可以检测到M蛋白同源二聚体,但与病毒粒子的侵入无关。虽然病毒粒子的感染需要些次级膜蛋白的协助.但GP5和M蛋白在病毒增殖中是必不可少的。根据目前所认可的GP5-MS白二聚体的拓扑结构进行分析，发现GP5和M蛋白在病毒粒子表面有一个很短的胞外域用来参与受体识别。GP5胞

14、外域含有几个糖基化位点，现已表明.GP5-M蛋白二聚体的形成发生在GP5精基化之前。GP5摭基化位点与ECN表位比较接近，目前有研究提出糖基化引起的空间位阻可能是PRRSV感染后NAbs延迟产生的原因之一。最近研究表明GP5-M异源二聚体可与PRRSV受体猪唾液酸粘附素发生相互作用，并且这种作用与GP5的糖基化有关，此糖基化位点很有可能与中和抗体识别表位重叠。如上所述,GP5和M贺白与PRRSV中和抗体的产生及细胞免疫的形成有关，这也表明,GP5-M异源二聚体是一种可用于建造有效疫苗最有前途的抗原结构。3.1.2表达GP5和M蛋白的rTGEV研究者设计了一个编码PRRSVGP5和M蛋白的双顺反

15、子TGEV,这两种蛋白在重组TGEV感染细胞中的表达率分别为85%和95%,并且，即使在rTGEV感染后的恢复期组织中也能维持相同的表达水平，这个结果基本上优于以前的单独表达PRRSV某一蛋白的rTGEVs（如GP5蛋白rTGEV可以高水平表达,但不稳定）。GP5蛋白与M蛋白共表达可降低GP5蛋白毒性同时也可能引起更好的T细胞免疫反应。通过体内试验对其保护性进行分析发现，无论是口腔，鼻腔还是胃内接种，在攻毒后都可产生较高的抗TGEV抗体反应，免疫动物也表现出抗PRRSVGP5和M蛋白体液免疫反应,在攻毒后发现免疫反应快速升高，因为疫苗组较对照组可更早的产生更高的抗体滴度,然而由rTGEV产生的

16、免疫反应的保护性却有限，这可能是因为在攻毒前中和抗体的产生水平较低的缘故。然而，使用rTGEV作为剌激PRRSV抗原体液免疫反应的载体仍是非常有前途的。3.2rTGEV系晚表达PRRSV蛋白的稳定性从细胞培养中获得的数据表明rTGEV载体表达PRRSV抗原并非完全稳定，主要是因为GP5蛋白的毒性导致CP5蛋白表达的显著丢失，相反的,M蛋白的表达非常稳定，在组织培养中至少有95%的感染细胞可以在大于10代次中稳定表达，在与连接非感染性抗原的rTGEV载体的比较中发现，GP5rTGEV载体中GP5蛋白表达的减少可能是rTGEV载体自我保护的一种结果。33rTGEV源性疫笛的保护性表达糖基化突变GP

17、5蛋白的灭活苗的制定，作为一种补充的方法，开发了一个基于rTGEV-GP5-N46S-M病毒(缺乏第一个糖基化位点的GP5蛋白与M蛋白共表达病毒)的灭活苗,通过对一周龄组免疫后攻毒发现,与对照组相比，疫苗组的动物可诱导更快，更高的RRRSV抗原的抗体，且中和抗体滴度也较对照组高。对实验动物的病毒血症，大体变化，及肺脏的病理变化观察发现，疫苗组明显减轻。这表明中和表位附近糖基化位点的消除可提高抗PRRSV保护性免疫反应。表达糖基化突变GP5蚩疗和M蛋白rTGEV的体内试验rTGEV-GP5-N46S-M活苗的体内保护性试验表明，接种1周龄猪6周后攻毒发现，所有猪在接种后都可产生较高的TGEV抗体

18、，攻毒后免疫组可产生明显的抗PRRSV抗体.对疫苗的保护性分析表明,疫苗株肺脏损伤程度明显低于对照组，但免疫反应并没能提供足够的保护作用，可能因为免疫组中和抗体表达水平与对照组并无差别。3.4TGEV浪性炭体发展集尊到目前为止，表达PRRSV抗原的rTGEV仅可产生部分保护,这可能与rTGEV载体不能稳定持续的表达PRRSV抗原有关，而其稳定性又主要与GP5蛋白的毒性有关,于此相反的是M蛋白的表达却很稳定。表达PRRSV抗原的rTGEV保护性不足还可能与表达的蛋白存在可以诱导负调节T细胞(Treg)的表位有关，由于免疫rTECV中的受体可诱导IF、的产生，这可能因为是RRRSVGP5或M蛋白的

19、可能存在诱导Trcg的负调剂信号。这种免疫反应负调节信号的产生可能也是延迟抗PRRSV保护性免疫反应的一个主要原因。为了提高rTGEV载体的稳定性，人们提出了不同的策略如，表达含有GP5保护性抗原表位但缺少不稳定性表达域的小片段等。4小结由于目前疫苗疗效的局限性，发展种新的PRRSV疫苗策略势在必行。现在改性活疫苗和病毒载体苗在刺激PRRSV免疫反应中已获得了很好的效果，但是，到目前为止，病毒载体的应用还不太令人满意，因此要解决这个问题必须开发一种新的载体。可以表达不同PRRSV抗原的TGEV源性载体作为一个新的候选者，它可以对PRRSV和TGEV两种病毒提供保护。与其它载体疫苗相比rTGEV

20、载体的使用具有很大的发展前景然而，与其它RNA病毒的报道一样,异源蛋白表达的稳定性是有限的。因此，增加PRKSV抗原表达的稳定性和清除可引发调节性T细胞的结构域是开发高效PRRSV疫苗的新途径。参考文献11Wissink.E.etal.Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiralorysyndromevinis|J.JVirol,2005.79(19):12495-12506.2Mateu.E.andI.Diaz,ThechallengeofPRRSimm

21、unologyfj.TheVeterinaryJournal.2008.177(3):345-351.3JLewis,CR，etal.Geneticperspectivesonhostresponsestoporcinereproductiveandnpiratorysyndrome(PRRS)|J|.Viralimmunolo©,2007.20(3):343-358.j4|Kimman,T.G.，etal.，Challengesforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)vaccinolog)JJ.Vaccine,

22、2009.27(28):3704-3718.|5Pomeranz,LE.,etal.andCJ.Hengartner,Molecularbiologyofpseudorabiesvirus:impactonneumvirologj1andveterinaryMicrobiologyandmolecularbiologyrevieHs.2005.69(3):462-500.6Nauwynck,H.，etal.,CellbiolofpcalandmolecularcharaclenKliesofpseudorabiesvirusinfectionsincellculturesandinpigswi

23、themphasisontherespiratorytract(J.Veterinaryresearch.2007.38(2):229-241.|7jJu,C.,etal，ImmunogenicityofarecombinantpscudorabicsvirusexpressingORF1/ORF2fusionproteinofporcinecircovirustype2(J).VetMicrobiol,2005.109(3):179-190.8 Qiu,H-J，etal.Protectiveimmunityinducedbyarecombinantpseu(loral>iesvirusexpn?ssingtheGP5ofporcinerrpruductiveandrespiratorysyndromevirusinpigjetsjJj.Veterinaryimmunologyandimmunopathology,2005.i06(3):309-319.9 Jiang.W，etal.，RecombinantadenovirusexpressingGP5andMfusionproteinso