遗传性非息肉病性结直肠癌的遗传学基础

1、    遗传性非息肉病性结直肠癌的遗传学基础        遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)是一种常见的常染色体显性遗传疾病，占所有大肠癌的1%5%1。通常HNPCC可以分为Lynch 综合症和Lynch 综合症两大类。Lynch 综合症又称遗传部位特异性结直肠癌(hereditary site-specific colorectal cancer, HSSCC)，在这类家系中大肠癌是

2、唯一的恶性肿瘤，往往发病比较早、70%位于近端结肠、常见同步或异步的大肠癌。根据Amsterdam(1991年)诊断标准2：家系中(1)至少有3例经组织病理学确诊的大肠癌患者，其中1例必须是另外2例的直系亲属；(2) 大肠癌必须累及连续的两代人；(3) 至少有1例大肠癌发病早于50岁。同时具备以上三个条件的家系才能被诊断为HNPCC。Lynch综合症又称癌症家庭综合症(cancer family syndrome,CFS)，除具有Lynch 综合症的所有特征外，还表现为肠外恶性肿瘤的高发生率，常见的有子宫内膜、胃、小肠、卵巢、胰腺、胆道等的腺癌、输尿管、肾盂等的移行细胞癌和血液系统的恶性疾病。

3、一、复制错误(replication error, RER)近十几年来的研究证实，大肠癌的发生、发展与癌基因的激活(如.ras基因)和/或抑癌基因(如.APC和p53基因)的失活密切相关。作为大肠癌的一种特殊类型，人们猜测HNPCC也肯定有其相关的遗传分子背景。在最初的遗传学连锁分析中，人们发现在大多数与HNPCC相关的肿瘤中存在着微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)或遗传不稳定性(genetic instability)，表现为复制错误(RER阳性)，即是与同一个体的正常组织细胞的DNA相比，肿瘤细胞的基因组DNA中单个、2个、3个或4个核苷酸组成的

4、重复序列的长度发生了改变3。据报道，在HNPCC家系中，86%(25/29)的大肠癌、57%(8/14)的大肠腺瘤和75%(3/4)的子宫内膜癌表现为RER阳性，相应的仅16%(8/49)的散发性大肠癌、3%(1/33)的散发性大肠腺瘤和17%(6/36)的散发性子宫内膜癌表现出复制错误4-5。与RER阴性的散发性大肠癌相比，RER阳性的散发性大肠癌具有许多与HNPCC大肠癌类似的特征，如多位于右半结肠(80%94%比.30%35%)，病理类型以粘液腺癌多见(82%比.20%30%)。二、人类错配修复基因(mismatch repair gene, MMR)在大肠杆菌和酵母菌中，微卫星的不稳定

5、已被证实与它们自身的错配修复系统缺陷有关。由此，人们联想到HNPCC肿瘤的RER表型可能是由人类的错配修复系统的突变引起的。自1993年末以来，已有5个人类错配修复基因hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2和GTBP先后被克隆成功，分别位于人类染色体2p2221、3p21.33.23、2p3133、7p22和2p16,其中hMSH2和GTBP与大肠杆菌mutS基因，hMLH1、hPMS1和hPMS2与mutL基因同源6-9。其中前4个基因的突变已被证实与HNPCC的发生有关，而GTBP基因的突变只会导致细胞的高突变性(hypermutability，与HNPCC的关系尚未被证实)。人体

6、细胞中的错配修复过程与大肠杆菌的类似。首先，hMSH2蛋白与GTBP结合成为hMutS-复合体，负责识别并结合到有碱基错配的DNA位点。然后，由hMLH1蛋白和hPMS2蛋白结合而成的hMutL-复合体再结合上去，启动新合成的DNA子链的剪切、重新合成和连接，以完成整个修复过程10。在此过程中，hPMS1蛋白的功能尚不明了。以上过程中，任一成分的失活都会导致整个错配修复系统的功能缺陷。目前，遗传学连锁分析和基因突变筛选的结果已证实hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2这4个MMR基因的突变与HNPCC的发生有关6-8，任一基因的突变都可导致HNPCC的发生。一般认为： MMR基因的突变

7、虽然不能直接导致细胞过度增殖，但是它们可使细胞错配修复功能缺陷或丧失，使细胞内重要的癌基因(比.K-ras)或和抑癌基因(比.APC,p53)的各种自发性的、非自发性的突变积累增多，在外界致癌因素的作用下，由此间接地改变细胞的表型，使细胞发生不可逆的癌变。三、HNPCC的遗传学诊断如前所述，传统的HNPCC的临床诊断主要依赖于家族史。因此，诊断的准确性很大程度上取决于所采的家族史的完整性和可靠性。如果我们能在一个给定的HNPCC家系中检测到MMR基因的突变，那么用这个遗传学结果结合家族史来诊断HNPCC将会比单一依靠家族史诊断来得更可靠。在临床诊断为HNPCC或临床可疑的HNPCC家系中检测M

8、MR基因的突变就是我们所指的HNPCC的遗传学诊断。1.突变率：根据遗传学连锁分析的结果估计，约40%和30%的HNPCC家系中可分别检测到hMSH2和hMLH1基因的种系突变，而hPMS1和hPMS2基因所占的比例较小，各占5%左右6-8。因此，hMSH2和hMLH1基因是HNPCC家系中主要的突变基因。在总共255个HNPCC家系中，20%和35%的家系中可分别检测到hMSH2和hMLH1基因的突变，也就是说共55%的家系是由hMSH2或hMLH1基因的突变引起的，较连锁分析估计的70%(40%+30%)有差距。这个差距提示：除了DNA水平的突变外，细胞中还可能存在着其他机制使MMR基因在

9、mRNA水平或蛋白水平失活，从而使细胞的错配修复功能缺陷或丧失。除hMSH2基因突变资料不全的39个瑞典家系外，在西方的美国、英国、瑞士、荷兰、俄国、澳大利亚等共180个家系中，总的突变检出率为62%(111/180)，其中hMSH2基因占21%(38/180)，hMLH1基因占41%(73/180)；而在东方的日本和韩国共36个家系中，总突变率仅为36%(13/36)，其中hMSH2基因占14%(5/36)，hMLH1基因占22%(8/36)。由此看来，MMR基因的突变率在东方人中明显低于西方人；且与连锁分析结果相矛盾的是，在东、西方人中hMLH1基因的突变率都高于hMSH2基因。2.突变类

10、型：根据已报道的突变来看，83%的hMSH2基因突变和80%的hMLH1基因突变都可导致相应蛋白质的缩短，引起短缩蛋白的突变可以是无义突变、小片段插入或缺失造成的移码突变和大片段编码区的读码内缺失。错义突变是另一类较常见的突变类型。在已报道的所有错义突变中，30%的hMSH2基因和33%的hMLH1基因的错义突变均发生在CpG双核苷酸处11。由于CpG双核苷酸在hMSH2和hMLH1基因的编码区中所占的百分比很小，均低于3%。因此，CpG双核苷酸位点可算是hMSH2和hMLH1基因突变的相对“热点”。3.突变分布：从已报道的突变来看，hMSH2基因的突变分散于各个外显子，无特定的突变“热点”，

11、而hMLH1基因的突变则多见于第15、16外显子12。另外,Han等发现在3个不相关的HNPCC家系中含有一个完全相同的、位于hMLH1基因第16外显子的移码突变，也提示了该位点是一个可能的突变“热点”13。4.突变筛选方法：筛选HNPCC家系中的错配修复基因的种系突变的分子生物学方法有很多种，简单地可分为两大类： DNA依赖性和RNA依赖性方法。DNA依赖性方法包括单链DNA构象多态性(single-strand configuration polymorphism, SSCP)、变性的梯度胶电泳(denatured gradient-gel electrophoresis, DGGE)和直

12、接的DNA测序等方法。RNA依赖性方法主要是指用体外转录和翻译系统(in vitro synthesized protein assay, IVSP)来检测有无短缩蛋白。这两大类方法各有优缺点。DNA依赖性方法的优点是：做为检测对象的DNA较RNA稳定，两个等位基因能同等数量地被扩增，DNA测序是最直接、最可靠的突变依据；缺点是：无法检测到大片段的基因组DNA缺失和发生在引物识别位点或扩增范围之外的突变，而漏掉了突变成为“假阴性”。此外，一一扩增每个基因的各个外显子工作量大且耗资甚巨。RNA依赖性方法可以弥补DNA依赖性方法的所有缺点，但也存在着不足之处。首先，IVSP并不是检测突变的直接方法

13、，它只是通过检测蛋白质水平的改变来间接地反映DNA水平的变化；其次，缺陷的等位基因可能不被表达或低表达，RNA的不稳定性都会影响结果的可靠性；再次，基因RNA本身存在的一些替代剪接(alternative splicing)产物可能会被当作“假阳性”，而导致误诊14。目前，对于突变的检测到底首选DNA或RNA依赖性方法尚有争议，结合两者应该是最为理想的。 作者单位： 310009杭州，浙江大学肿瘤研究所参考文献1Lynch HT, Smyrk TC, Watson P, et al. Genetics, natural history, tumor spectrum, and patholog

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